豚鼠Ⅱ細鈣關肽型前庭毛胞降素基因相研作用機制的究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：豚鼠前庭毛細胞的改良分離方法
　　 目的：改良原有的前庭毛細胞分離方法，建立一種快速獲得更多數(shù)量和更高活性的前庭毛細胞的方法。
　　 方法：將耳廓反射正常的豚鼠20只(體重250-300g)，每次實驗用兩只豚鼠，共取得四個聽泡分為隨機分為A、B、C、D 四組。A組：膠原酶ⅠA+鋼針+普通玻璃滴管吹打；B組：膠原酶ⅠA+鋼針+微量加樣器吹打；C組：膠原酶ⅠA+微量加樣器吹打；D組

2、：胰酶分離+微量加樣器吹打。通過光鏡、膜片鉗等方法評價細胞狀態(tài)。
　　 結(jié)果：A組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ(Ⅰ型前庭毛細胞)73.1個，VHCs Ⅱ(Ⅱ型前庭毛細胞)7.1個。纖毛損失細胞率(以纖毛缺失大于3/4 為標準計數(shù))：VHCs Ⅰ為28[％]，VHCs Ⅱ為45[％]。3小時后水腫細胞率：VHCs Ⅰ為28[％]，VHCs Ⅱ為37[％]。B組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ69.2個，VHCs Ⅱ6.4個。纖

3、毛損失細胞率：VHCs Ⅰ為18[％]，VHCs Ⅱ為31[％]。3小時后水腫細胞率：VHCs Ⅰ為19[％]，VHCs Ⅱ為35[％]。C組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ107.9個，VHCs Ⅱ毛細胞14.5個。纖毛損失細胞率：VHCs Ⅰ為18[％]，VHCs Ⅱ為28[％]。3小時后水腫細胞率：VHCs Ⅰ為10[％]，VHCs Ⅱ為17[％]。D組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ102.8個，VHCs Ⅱ毛細胞12個。纖毛損

4、失細胞率：VHCs Ⅰ為20[％]，VHCs Ⅱ為39[％]。3小時后水腫細胞率：VHCs Ⅰ為13[％]，VHCs Ⅱ為28[％]。
　　 結(jié)論：本實驗所采用的“膠原酶ⅠA 加微量加樣器吹打”分離的細胞，清潔玻璃培養(yǎng)皿中淺液體沉淀，能夠在更短的時間，提供較以往傳統(tǒng)方法更多數(shù)目，更高質(zhì)量的單個前庭毛細胞。
　　 第二部分：豚鼠Ⅱ型前庭毛細胞 CGRP 敏感性ATP 依賴性鉀電流
　　 目的：研究豚鼠前庭終器Ⅱ型前

5、庭毛細胞(VHCs Ⅱ)降鈣素基因相關肽(Calcitoningene-related peptide，CGRP)敏感性電流的特性。
　　 方法：應用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測新鮮單離的豚鼠前庭終器Ⅱ型前庭毛細胞CGRP敏感性鉀電流的離子特性及其藥理學特點。
　　 結(jié)果：1.-50mV 鉗制電壓下，細胞外CGRP激活一緩慢持久的外向性電流，其I-V 曲線反轉(zhuǎn)電位為(-65±10) mV，有內(nèi)向整流性質(zhì),其效應呈濃度依賴性,半數(shù)

6、激活濃度為39.8nM。2.該電流對CGRP 受體阻斷劑CGRP8-37敏感，PA2 值為7.5>7，提示該受體為CGRP1型受體。3.不同鈣濃度對CGRP電流沒有明顯影響。4.該電流可被胞外RPcAMP,Glibenclamide 明顯抑制，對胞外TEA(tetraethylammonium)不敏感。
　　 結(jié)論：細胞外CGRP通過CGRP1型受體經(jīng)由AC-cAMP-PKA 系統(tǒng)激活豚鼠前庭終器Ⅱ型前庭毛細胞ATP 依賴性鉀通