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文檔簡介
1、本研究分為二部分:
第一部分:豚鼠前庭毛細胞的改良分離方法
目的:改良原有的前庭毛細胞分離方法,建立一種快速獲得更多數(shù)量和更高活性的前庭毛細胞的方法。
方法:將耳廓反射正常的豚鼠20只(體重250-300g),每次實驗用兩只豚鼠,共取得四個聽泡分為隨機分為A、B、C、D 四組。A組:膠原酶ⅠA+鋼針+普通玻璃滴管吹打;B組:膠原酶ⅠA+鋼針+微量加樣器吹打;C組:膠原酶ⅠA+微量加樣器吹打;D組
2、:胰酶分離+微量加樣器吹打。通過光鏡、膜片鉗等方法評價細胞狀態(tài)。
結(jié)果:A組:平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ(Ⅰ型前庭毛細胞)73.1個,VHCs Ⅱ(Ⅱ型前庭毛細胞)7.1個。纖毛損失細胞率(以纖毛缺失大于3/4 為標準計數(shù)):VHCs Ⅰ為28[%],VHCs Ⅱ為45[%]。3小時后水腫細胞率:VHCs Ⅰ為28[%],VHCs Ⅱ為37[%]。B組:平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ69.2個,VHCs Ⅱ6.4個。纖
3、毛損失細胞率:VHCs Ⅰ為18[%],VHCs Ⅱ為31[%]。3小時后水腫細胞率:VHCs Ⅰ為19[%],VHCs Ⅱ為35[%]。C組:平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ107.9個,VHCs Ⅱ毛細胞14.5個。纖毛損失細胞率:VHCs Ⅰ為18[%],VHCs Ⅱ為28[%]。3小時后水腫細胞率:VHCs Ⅰ為10[%],VHCs Ⅱ為17[%]。D組:平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ102.8個,VHCs Ⅱ毛細胞12個。纖毛損
4、失細胞率:VHCs Ⅰ為20[%],VHCs Ⅱ為39[%]。3小時后水腫細胞率:VHCs Ⅰ為13[%],VHCs Ⅱ為28[%]。
結(jié)論:本實驗所采用的“膠原酶ⅠA 加微量加樣器吹打”分離的細胞,清潔玻璃培養(yǎng)皿中淺液體沉淀,能夠在更短的時間,提供較以往傳統(tǒng)方法更多數(shù)目,更高質(zhì)量的單個前庭毛細胞。
第二部分:豚鼠Ⅱ型前庭毛細胞 CGRP 敏感性ATP 依賴性鉀電流
目的:研究豚鼠前庭終器Ⅱ型前
5、庭毛細胞(VHCs Ⅱ)降鈣素基因相關肽(Calcitoningene-related peptide,CGRP)敏感性電流的特性。
方法:應用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測新鮮單離的豚鼠前庭終器Ⅱ型前庭毛細胞CGRP敏感性鉀電流的離子特性及其藥理學特點。
結(jié)果:1.-50mV 鉗制電壓下,細胞外CGRP激活一緩慢持久的外向性電流,其I-V 曲線反轉(zhuǎn)電位為(-65±10) mV,有內(nèi)向整流性質(zhì),其效應呈濃度依賴性,半數(shù)
6、激活濃度為39.8nM。2.該電流對CGRP 受體阻斷劑CGRP8-37敏感,PA2 值為7.5>7,提示該受體為CGRP1型受體。3.不同鈣濃度對CGRP電流沒有明顯影響。4.該電流可被胞外RPcAMP,Glibenclamide 明顯抑制,對胞外TEA(tetraethylammonium)不敏感。
結(jié)論:細胞外CGRP通過CGRP1型受體經(jīng)由AC-cAMP-PKA 系統(tǒng)激活豚鼠前庭終器Ⅱ型前庭毛細胞ATP 依賴性鉀通
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