牛體外受精胚胎及克隆胚胎發(fā)育過程中組蛋白修飾表觀遺傳重編程的研究.pdf

1、雖然體細胞克隆技術已經(jīng)在多種動物中得以實現(xiàn),但克隆胚胎懷孕率低、出生后異常等問題,嚴重制約了體細胞克隆技術的開發(fā)應用。有研究證實,供體細胞核在受體卵母細胞中不完全或異常的表觀遺傳重編程是導致克隆胚胎發(fā)育異常的重要原因。基因組DNA甲基化、組蛋白的共價修飾是重要的表觀遺傳修飾,二者具有復雜而廣泛的生物學功能。在正常生殖細胞發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中,染色體要經(jīng)歷廣泛的DNA甲基化、去甲基化,核小體核心組蛋白也要通過各種共價修飾調(diào)節(jié)染色體功能,從

2、而完成遺傳信息的傳遞和調(diào)控胚胎的發(fā)育。目前,雖然已初步證實克隆胚胎存在DNA甲基化的異常,但組蛋白共價修飾是否也存在異常,還不是很清楚。為了深入探討克隆胚胎組蛋白修飾的重編程,闡明胚胎的發(fā)育機理,進而改善克隆效率,本研究較系統(tǒng)的探討了牛卵母細胞體外成熟、體外受精及胚胎體外發(fā)育過程中組蛋白修飾的動態(tài)變化,比較了體外受精胚胎與克隆胚胎早期發(fā)育過程中組蛋白修飾的差異。使用組蛋白去乙?；敢种苿w細胞及受體卵母細胞進行了處理,檢測了藥物對供

3、、受體表觀遺傳修飾以及克隆胚胎發(fā)育的影響,并對處理后供體核在去核卵母細胞中組蛋白修飾的重編程進行了分析。 本研究探討了組蛋白H3、H4不同甲基化、乙?；揎椢稽c在牛卵母細胞體外成熟、體外受精及胚胎體外發(fā)育不同階段的動態(tài)變化。結果顯示,組蛋白H3、H4甲基化、乙酰化具有明顯的階段性變化。在卵母細胞成熟過程中,不同組蛋白不同修飾位點經(jīng)歷階段性的、特異性去乙酰化,組蛋白甲基化則在卵母細胞成熟過程中沒有明顯變化。在精卵融合、精子核解凝集

4、和重凝集過程中,乙?；M蛋白H3、H4迅速定位于精子染色質(zhì),隨后強的乙?；盘柖ㄎ挥谛墼?。與此同時,在卵母細胞核中,除H4K5ac,并沒有檢測到其他乙?；盘?；到染色質(zhì)重新凝集時,檢測到弱乙?；盘?H3K9ac、H4K5ac、H4K8ac);而到雌原核形成時,乙?；揎椉訌姟?甲基化的H3K9me2和H3K4me3熒光信號在精子核膨大期和染色質(zhì)再凝集期并沒有出現(xiàn)；到原核形成時,雄性染色體組蛋白才逐漸被甲基化。與此同時,上述組

5、蛋白甲基化信號在卵母細胞原核形成過程中維持了較高的水平。 在隨后的胚胎發(fā)育過程中,所研究的四種乙?；M蛋白均存在于牛胚胎發(fā)育的各個時期,其中組蛋白H3K9ac,H3K18ac在8-細胞期明顯減弱,到桑椹胚時增強。H4K8ac,H4K5ac在胚胎發(fā)育的不同階段都具有較強的熒光信號,但在2-、4-和8-細胞期胚胎的間期卵裂球中,H4K8ac、H4K5ac定位于細胞核周邊；而在分裂相的卵裂球中,H4K8ac、H4KSac定位于凝聚染色

6、體,且H4K5ac信號明顯減弱。H3K18ac、H4K8ac、H4K5ac信號在囊胚滋胚層的染色較內(nèi)細胞團強。與組蛋白乙?；啾?甲基化H3K4在8-細胞期幾乎完全消失,在隨后的發(fā)育過程中,熒光信號有所恢復,而H3K9me2在8-細胞以后各期胚胎中則明顯增強。上述結果表明,卵母細胞成熟有其特異的組蛋白修飾動態(tài)轉變,組蛋白乙?；饾u被去除；受精是組蛋白甲基化、乙酰化逐漸恢復的過程,且不同修飾位點有其自身的動態(tài)變化特點；在胚胎發(fā)育過程中維持

7、了組蛋白乙酰化、甲基化修飾。在受精及胚胎發(fā)育過程中,相同組蛋白的不同位點有相似的變化模式(H3K9ac vsH3K18ac;H4K8ac vs H4K5ac);功能相關的不同組蛋白修飾有其類似的動態(tài)變化(H3K9ac、H3K18ac vs H3K4me3),并且組蛋白乙酰化在牛胚胎細胞核中的定位也可能與合子基因組激活有關(H4K8ac、H4K5ac);而且組蛋白修飾與DNA甲基化密切相關(H3K9me2)。 2.牛體外受精胚胎與體細胞克

8、隆胚胎發(fā)育過程中組蛋白修飾的比較通過體細胞克隆技術構建重構胚胎并與體外受精來源的胚胎對組蛋白修飾的差別進行了比較。間接免疫熒光技術顯示,從原核期到8-細胞期,克隆胚胎與體外受精胚胎存在著明顯的組蛋白乙?；?、甲基化修飾的差異。高水平的H3K9ae、H3K18ac、H4K5ac、H4K8ac、H3K4me3和H3K9me2存在于8-細胞期之前的各期克隆胚胎中,并且H4K5ac和H4K8ac在克隆胚胎細胞核中的定位與體外受精胚胎也存在明顯差異

9、。8-細胞期以后,除了H3K9me2,其他組蛋白乙酰化、甲基化修飾的熒光強度及定位,在克隆胚胎都與體外受精胚胎類似。因此,克隆胚8-細胞前的發(fā)育階段,存在著明顯的組蛋白修飾異常,但當供體核基因組被激活,供體核組蛋白修飾經(jīng)歷較大程度的重編程,使得克隆胚胎與體外受精胚胎具有類似的組蛋白修飾模式。 3.TSA處理轉基因體細胞對克隆胚胎發(fā)育的影響Trichostatin A(TSA)作為特異的組蛋白去乙酰化酶抑制劑,能夠增加細胞的組蛋白

10、乙?；?激活基因的表達,本試驗使用TSA處理轉基因供體細胞,并對基因組DNA甲基化水平、組蛋白乙?；?、報告基因的表達及克隆胚胎的發(fā)育進行了分析。結果表明轉基因供體細胞對TSA存在明顯的劑量效應,TSA濃度為100ng/mL時,產(chǎn)生明顯的細胞毒性,大量細胞死亡(P<0.01)。當TSA在較低濃度(5-50ng/mL)時,細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞增殖明顯被抑制,S期細胞明顯減少,細胞被抑制于G0/G1期。核型分析顯示,TSA處理沒有導

11、致轉基因細胞異常核型的形成。使用10-50ng/mL TSA處理供體細胞,明顯增加了表達報告基因細胞的數(shù)量,基因組DNA甲基化水平降低,組蛋白乙?；皆黾印Ｊ褂媒?jīng)TSA處理的體細胞作為核供體進行核移植,獲得了類似的卵裂、桑椹胚及囊胚率。當TSA濃度為50ng/mL時,抑制了桑椹胚(14.8％vs 27.3％、38.9％,P<0.05),囊胚的發(fā)育(9.9％vs 20.7％、26.3％,P<0.05)。轉基因體細胞經(jīng)TSA處理后,表達e

12、GFP基因的囊胚數(shù)明顯增加。結論:TSA處理供體細胞明顯改變了轉基因供體細胞的表觀遺傳特性,激活報告基因表達,報告基因表達的改變可以作為判定基因組DNA甲基化水平轉變的標志。TSA處理供體細胞明顯增加表達報告基因的囊胚數(shù),但具有低水平DNA甲基化、高水平組蛋白乙?；霓D基因供體細胞并沒有提高克隆胚胎的發(fā)育率。 4.TSA處理卵母細胞對克隆胚胎發(fā)育及表觀遺傳重編程的影響本試驗使用組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)處理卵母細胞,探討其

13、對卵母細胞組蛋白乙?；?、克隆胚胎發(fā)育及供體細胞染色質(zhì)重編程的影響。結果表明卵母細胞成熟率與TSA濃度呈明顯的劑量相關,較高濃度TSA(>2.5ng/mL)處理,抑制了卵母細胞體外成熟,卵母細胞被抑制于MI期(10ng/mL、61.9％vs對照、31.4％,P<0.05)。分析處理后卵母細胞核型顯示,TSA(1、10ng/mL)處理沒有明顯影響卵母細胞的核型(85.5％、85.9％vs 81.8％,P>0.05),且藥物處理后明顯增加了卵

14、母細胞組蛋白乙?；?。TSA處理后的卵母細胞既促進了孤雌胚胎的發(fā)育(0.5ng/mL、28.7％,1ng/mL、36.4％,2.5ng/mL、25.9％,5ng/mL、27.1％vs對照、19.0％),也促進了克隆胚胎的發(fā)育(1ng/mL、39.3％vs對照、25.7％,P<0.05),但是處理組與對照組囊胚細胞數(shù)沒有明顯差異。檢測兩種克隆胚胎1-細胞階段的組蛋白修飾顯示,供體細胞染色質(zhì)在受體中經(jīng)歷去乙?；耙阴；亟?。當供體細胞核發(fā)

15、生早期染色體凝集時,對照和處理組H3K9ac、H3K18ac熒光信號消失；對照組供體染色體H4K8ac明顯減弱,處理組該位點乙?；?；體細胞核H4K5ac信號在對照組卵母細胞中沒有明顯變化,處理組H4K5ac信號明顯減弱。當重構胚被激活時,所用組蛋白乙?；盘栄杆倩謴?。TSA處理的卵母細胞還明顯增加了供體染色質(zhì)的穩(wěn)定性(74.2％vs39.6％,P<0.01)。結論：相對高濃度的TSA處理卵母細胞導致乙?；矫黠@升高,并且高的組蛋白