多西紫杉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的毒性與放射增敏作用研究.pdf

1、研究背景原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，其死亡率位居各類腫瘤第二位。現(xiàn)代精確放療是治療肝癌的常用手段之一。然而，在給予足以殺滅腫瘤組織放射劑量的同時(shí)常會(huì)損傷周圍重要組織。而許多腫瘤由于其本身對(duì)射線抵抗或腫瘤內(nèi)存在大量對(duì)放射線不敏感的乏氧細(xì)胞，即使給予足夠的射線劑量仍無法有效控制腫瘤。因此，有關(guān)放射增敏劑的研究具有重要臨床意義。多西紫杉醇是一種新型半合成紫杉醇類衍生物，體外研究表明，多西紫杉醇可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期分布<'[

2、1]>。臨床研究證實(shí)多西紫杉醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有放射增敏作用且不加重正常組織的放射損傷，但有關(guān)多西紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞的放射增敏鮮見報(bào)道。 研究目的本實(shí)驗(yàn)研究旨在探索多西紫杉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的細(xì)胞毒性及放射增敏作用，為有效提高肝癌的放療效果提供試驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法(1) 將復(fù)蘇的人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721進(jìn)行傳代培養(yǎng)，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，定期換液及傳代，待細(xì)胞生長良好，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后進(jìn)行試驗(yàn)。 (2

3、) MTT 法測定多西紫杉醇對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制作用。(3) 熒光倒置相差顯微鏡觀察濃度為IC50的多西紫杉醇不同處理時(shí)間后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 (4) MTT 法測定多西紫杉醇對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的放射增敏作用。 (5) 流式細(xì)胞分析方法檢測多西紫杉醇聯(lián)合放射線對(duì)細(xì)胞周期的影響。(6) 流式細(xì)胞分析方法檢測多西紫杉醇聯(lián)合放射線對(duì)細(xì)胞周期影響的時(shí)效性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1) 人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721傳代培養(yǎng)3

4、天后，細(xì)胞生長良好，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。(2)各濃度的多西紫杉醇分別作用3 h，6 h，9 h，1 2 h，24 h，48 h后，細(xì)胞抑制率隨著藥物濃度的增加而升高，隨著藥物作用時(shí)間的延長而升高，且藥物濃度和處理時(shí)間之間存在協(xié)同作用。析因方差分析結(jié)果表明不同藥物濃度處理組中除200μg/ml，400μg/ml外，其他各濃度處理組間兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=15723.685，P=0.0000)，不同處理時(shí)間組間細(xì)胞抑制率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差

5、異(F=11740.167，P=0.0000)，不同濃度和時(shí)間協(xié)同組間細(xì)胞抑制率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=739.916，P=0.0000)。多西紫杉醇對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的IC50為21.69μg/ml，95﹪的可信區(qū)間為19.12μg/ml～24.60μg/ml。確定隨后的增敏實(shí)驗(yàn)選擇濃度為：4μg/ml。(3)熒光倒置相差顯微鏡(200×)觀察顯示：正常腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊狀排列，團(tuán)塊內(nèi)細(xì)胞數(shù)量不等，細(xì)胞間排列緊密；細(xì)胞大小不一，異形性

6、明顯，呈梭形或多角形；胞膜、胞漿等細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)清晰。胞核卵圓形，核膜清晰，核仁明顯。藥物作用于細(xì)胞后3 h：腫瘤細(xì)胞體積增大，胞膜、胞漿、核膜等細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)顯示不清，核仁尚清；6 h：多數(shù)細(xì)胞間出現(xiàn)融合現(xiàn)象，呈團(tuán)塊狀，團(tuán)塊內(nèi)細(xì)胞各結(jié)構(gòu)均顯示不清，細(xì)胞表面可見大小不等、分布均勻的空泡；9 h：細(xì)胞內(nèi)空泡開始融合變大，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)各結(jié)構(gòu)顯示更不清楚；12 h：細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞表面可見黑色顆粒并均勻分布，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)各結(jié)構(gòu)無法分辨，部分細(xì)胞固縮、變圓

7、；24 h：細(xì)胞排列松散，細(xì)胞間隙增大，僅見模糊的細(xì)胞大體輪廓，細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)無法分辨，胞膜仍可見。細(xì)胞表面散在空泡，胞漿缺失。細(xì)胞開始固縮、溶解，并可見典型的核固縮、核碎裂及細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象；48 h：細(xì)胞排列更為松散，胞膜不完整，表現(xiàn)為變性或溶解樣壞死。 (4)多西紫杉醇預(yù)處理3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h后照射，不同預(yù)處理時(shí)間組間SER有顯著性差異(F=32.43 935，P=0.0000)，不同預(yù)處理時(shí)間組間

8、兩兩比較均具顯著性差異(P<0.05)。各組SER分別為：1.21、1.33、1.50、1.68、1.72、1.83，隨預(yù)處理時(shí)間延長，SER逐漸增加，在預(yù)處理3 h～1 2 h期間，SER增高速率最快，此后隨孵育時(shí)間延長，SER呈較為平緩增長趨勢。 (5)單純4μg/ml多西紫杉醇處理和2 Gy照射均引起明顯的細(xì)胞周期G<,2>/M期阻滯，且多西紫杉醇與照射有協(xié)同作用。 (6)隨著多西紫杉醇預(yù)處理時(shí)間的延長，G<,2>/M期細(xì)胞所占比