鴨疫里默氏菌dnaK基因功能初析.pdf

1、鴨疫里默氏菌(RA)可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，引起一種急性敗血性或慢性傳染病，常給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了研究RA的DnaK是否具有分子伴侶的基本特征，以及在熱脅迫等應(yīng)激條件下是否發(fā)揮作用，本文進(jìn)行了一系列的研究，獲得如下結(jié)果。
　　1、將本實(shí)驗(yàn)室分離保存的RA野毒株RA-CH-1株dnaK、dnaJ和grpE全基因序列分別克隆到表達(dá)載體pET32a(+)載體中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)dnaK、pET32a(

2、+)dnaJ和pET32a(+)grpE并將其分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，成功表達(dá)出DnaK、DnaJ和GrpE重組蛋白，用親和層析的方法獲得純度較高的重組蛋白。
　　2、用超微量ATP測(cè)試盒分別測(cè)定純化的重組蛋白DnaK、DnaJ和GrpE在K+/Na+或Mg2+/Ca2+環(huán)境中水解ATP的活性。結(jié)果顯示，重組蛋白DnaJ和GrpE不具有ATPase活性;而重組蛋白DnaK具有微弱的ATPase活性且DnaJ和GrpE可增強(qiáng)Dn

3、aK的ATPase活性，反應(yīng)溫度50℃時(shí)DnaK的ATPase活性最高。
　　3、用純化的DnaK蛋白免疫小鼠制備鼠抗DnaK多克隆抗體，間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)達(dá)到1∶102400。Western blot檢測(cè)鼠抗DnaK與RA-CH-1全菌蛋白及純化的DnaK蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果顯示該抗體能特異性地識(shí)別RA的DnaK蛋白。
　　4、以不同應(yīng)激條件處理RA-CH-1，提取RNA，熒光定量PCR檢測(cè)其dnaK的mRNA水平，

4、結(jié)果表明，當(dāng)RA受到熱、H2O2、氨基糖苷類抗生素脅迫及滲透壓的作用時(shí)，其dnaK的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高;受到酸堿脅迫時(shí)，dnaK的mRNA水平無明顯變化。
　　5、根據(jù)RA的DnaK與大腸桿菌的DnaK氨基酸序列一致性達(dá)60％以上，利用λred重組的方法獲得缺失了dnaK的大腸桿菌XL1-Blue△dnaK株，同時(shí)構(gòu)建的RA DnaK原核表達(dá)載體pBAD24dnaK轉(zhuǎn)化XL1-Blue△dnaK獲得缺失回補(bǔ)株，在不同溫度的應(yīng)激條件下

5、測(cè)定親本株E.coliXL1-Blue、缺失株E.coli XL1-Blue△dnaK和缺失回補(bǔ)株E.coliXL1-Blue△dnaK pBAD24dnaK的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果親本株E.coliXL1-Blue生長(zhǎng)良好，缺失株E.coliXL1-Blue△dnaK在42℃時(shí)不生長(zhǎng)，而回補(bǔ)了RA DnaK的E.coliXL1-Blue△dnaK pB AD24dnaK生長(zhǎng)速率得到一定的恢復(fù)。表明RADnaK不僅能在一定程度上增強(qiáng)大腸桿菌XL