可注射性殼聚糖-磷酸甘油復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)豬關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性研究.pdf

1、由創(chuàng)傷或退變所致的關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床關(guān)節(jié)外科十分常見(jiàn)，而損傷關(guān)節(jié)軟骨的自身修復(fù)能力又很有限，通常導(dǎo)致患者功能障礙、生活質(zhì)量下降。關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)與功能重建是關(guān)節(jié)外科一大難題，也是近年研究熱點(diǎn)之一。目前臨床所用修復(fù)軟骨缺損的主要方法包括“微骨折技術(shù)”、“鑲嵌成形術(shù)”、軟骨細(xì)胞移植、骨膜和軟骨膜移植等。雖然這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都存在一定缺陷，組織工程技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生與修復(fù)提供了新的思路和方法。 根據(jù)支架制備特點(diǎn)的不同，組

2、織工程軟骨可分為預(yù)制成型軟骨和可注射性軟骨兩類(lèi)。近年，預(yù)制成型軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究取得了顯著進(jìn)展，其部分產(chǎn)品已成功用于臨床，并取得較好療效，但其臨床應(yīng)用仍存在很大限制。一方面，預(yù)制成型軟骨需要開(kāi)放手術(shù)將其植入軟骨缺損，開(kāi)放手術(shù)可引起關(guān)節(jié)囊、滑膜和韌帶等正常關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，增加病人的痛苦，延長(zhǎng)康復(fù)時(shí)間，甚至引起感染、關(guān)節(jié)僵硬等并發(fā)癥。另一方面，預(yù)制成型軟骨制備過(guò)程較復(fù)雜，在術(shù)中塑形及與缺損周?chē)逗线B接欠佳?？勺⑸湫攒浌堑某霈F(xiàn)正好彌補(bǔ)了

3、預(yù)制成型軟骨的上述不足，可注射性軟骨可通過(guò)微創(chuàng)方式植入，操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，與缺損周?chē)逗线B接好，可根據(jù)缺損軟骨形狀任意塑形，特別適合形狀不規(guī)則軟骨缺損的修復(fù)，大大提高了臨床應(yīng)用的可操作性，成為組織工程軟骨臨床應(yīng)用的發(fā)展方向。目前，可注射性軟骨的研究尚處于早期階段，研究?jī)?nèi)容主要集中于可注射性支架的材料篩選、制備及異位軟骨構(gòu)建等，尚未找到比較理想的種子細(xì)胞和可注射性支架，更缺少可注射性軟骨原位注射修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的相關(guān)研究。這一技術(shù)從動(dòng)物實(shí)

4、驗(yàn)過(guò)渡到臨床應(yīng)用，還有以下幾個(gè)方面的重要問(wèn)題需要解決：1．種子細(xì)胞的來(lái)源；2．可注射性支架的材料選取及制備；3．可注射性軟骨原位注射修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。為此，本研究針對(duì)以上問(wèn)題，以豬關(guān)節(jié)軟骨缺損為動(dòng)物模型，研究了殼聚糖/磷酸甘油可注射性支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和成軟骨分化的影響及用作骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的載體體外構(gòu)建組織工程軟骨和體內(nèi)原位注射修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。 首先，通過(guò)骨髓穿刺獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并行體外擴(kuò)增

5、培養(yǎng)；把適當(dāng)比例的殼聚糖溶液與磷酸甘油溶液混和后；將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入殼聚糖/磷酸甘油混合液構(gòu)建殼聚糖/磷酸甘油-細(xì)胞凝膠復(fù)合物，并在體外三維培養(yǎng)及成軟骨誘導(dǎo)分化，觀察殼聚糖/磷酸甘油凝膠復(fù)合物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和成軟骨分化的影響及殼聚糖/磷酸甘油-細(xì)胞凝膠復(fù)合物形成軟骨組織能力。結(jié)果顯示： 1、以1×10<'5>個(gè)細(xì)胞/cm<'2>的密度接種的骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞，5-6天可長(zhǎng)滿單層； 2、殼聚糖/磷酸甘油凝膠

6、復(fù)合物支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及成軟骨分化； 3、殼聚糖/磷酸甘油-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凝膠復(fù)合物在體外培養(yǎng)過(guò)程中能保持其初始外形； 4、殼聚糖/磷酸甘油-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凝膠復(fù)合物能在體外成軟骨培養(yǎng)中形成軟骨組織； 5、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。 其次，將殼聚糖/磷酸甘油-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合液白體注射入膠原膜覆蓋的豬全厚關(guān)節(jié)軟骨缺損處，原位固化構(gòu)建組織工程軟骨以修復(fù)軟骨缺

7、損，采用大體觀察、修復(fù)結(jié)果分級(jí)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、GAG定量和磁共振等檢測(cè)可注射組織工程軟骨自體移植修復(fù)軟骨缺損的可行性。結(jié)果顯示： 1、術(shù)后8周和16周，缺損區(qū)為透明軟骨組織填充，蕃紅O和Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性； 2、移植區(qū)內(nèi)及移植區(qū)周?chē)窗l(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，也無(wú)血管侵入； 3、術(shù)后16周組織工程軟骨組織GAG含量顯著高于對(duì)照組，磁共振顯示修復(fù)區(qū)軟骨形態(tài)和信號(hào)正常。 綜上所述，從本實(shí)驗(yàn)可以得出如