中國(guó)人HD EDNRB-EDN3基因突變篩選及RET+3位點(diǎn)的多態(tài)性分析.pdf

1、研究背景：先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung'sdisease，簡(jiǎn)稱HD)，又稱腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，發(fā)病率為1/5000，在胃腸道先天性畸形疾病中占第二位，男女發(fā)病比例約4∶1。臨床上表現(xiàn)為完全性或不完全性腸梗阻癥狀，嚴(yán)重影響小兒的生活質(zhì)量，甚至危及生命。HD主要發(fā)病原因是腸壁肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，以致受累腸段異常收縮，其近端結(jié)腸代償性擴(kuò)張肥厚，形成巨結(jié)腸。近年來(lái)，HD發(fā)病率有所上升，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。HD是一種病因復(fù)雜的

2、疾病，雖然HD的病理學(xué)基礎(chǔ)為病變腸段神經(jīng)元細(xì)胞缺失，但神經(jīng)元細(xì)胞缺失的原因至今仍有爭(zhēng)議。所以進(jìn)一步明確HD的發(fā)病機(jī)理，降低HD的發(fā)病率，并探索有效的非創(chuàng)傷性治療方法，成為目前最為關(guān)注的問(wèn)題。 HD的發(fā)病與多種因素有關(guān)，包括基因遺傳因素和微環(huán)境的影響。其中，基因遺傳因素被認(rèn)為是影響其發(fā)病的主要原因，HD屬于典型的多基因遺傳病。目前，已經(jīng)有十余種基因和4個(gè)區(qū)域被證實(shí)與HD的發(fā)病有關(guān)，如RET、EDNRB、EDN3、GDNF、SOX1

3、0、ECE-1、Neurturin、9q31等。 近年來(lái)，RET基因已經(jīng)被證實(shí)是HD的主要致病基因。RET基因編碼一種酪氨酸激酶受體，該受體為跨膜蛋白聚合體，有1114個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其主要功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化信號(hào)，在細(xì)胞外環(huán)境和細(xì)胞核之間起連接作用。據(jù)國(guó)外資料統(tǒng)計(jì)，家族性HD約40-50％存在RET基因突變，散發(fā)性為15-20％。 至今，國(guó)外的研究已發(fā)現(xiàn)90多種RET基因突變類型，散發(fā)于20個(gè)外顯子中，突變方式除

4、個(gè)別為大片段缺失外，多數(shù)為點(diǎn)突變。近年來(lái)，還發(fā)現(xiàn)RET基因上的一些特殊單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位點(diǎn)與HD具有緊密的關(guān)聯(lián)，如外顯子2上的A45A，外顯子13上的L769L。2005年，Chakravarti等通過(guò)對(duì)126個(gè)HD家系的研究，發(fā)現(xiàn)RET基因內(nèi)含子1中6個(gè)SNPs與HD密切相關(guān)，特別是RET+3位點(diǎn)。該位點(diǎn)位于多種屬保守序列MCS+9.7內(nèi)，具有重要意義。迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)

5、HD患者RET基因突變的研究已有報(bào)道，但對(duì)RET基因上多態(tài)性位點(diǎn)與HD關(guān)聯(lián)性的研究尚未見報(bào)道。 EDNRB基因位于13q22，長(zhǎng)約24kb，含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白為G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，包括七個(gè)跨膜區(qū)。EDNRB及其配體介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育具有重要的作用。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EDNRB基因缺失可以使實(shí)驗(yàn)鼠產(chǎn)生巨結(jié)腸，并且該動(dòng)物模型比RET基因缺失產(chǎn)生的HD模型，更接近于人類的HD表型。而位于20號(hào)染色體的

6、EDN3基因則編碼EDNRB蛋白最為重要的配體EDN3，如EDN3基因編碼區(qū)發(fā)生突變，引起蛋白功能改變或者蛋白前體不能水解為功能性蛋白，則同樣會(huì)對(duì)EDNRB/EDN3信號(hào)通路產(chǎn)生影響，引起HD的發(fā)生。至今，國(guó)外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)17種EDNRB基因突變型，突變率5-10％，而EDN3基因突變型更為少見，約6種。至今，對(duì)中國(guó)人HDEDNRB與EDN3基因的突變研究尚少。 研究目的：(1)研究中國(guó)人散發(fā)性HDEDNRB、EDN3基因突變類

7、型、突變方式和突變率等特征，探討HD的發(fā)病機(jī)理，揭示中國(guó)人散發(fā)性HD與EDNRB、EDN3基因突變的關(guān)系。(2)研究中國(guó)人散發(fā)性HD與RET基因上SNP位點(diǎn)RET+3、rs2506004、rs2506005的關(guān)聯(lián)性，揭示SNP位點(diǎn)在中國(guó)人散發(fā)性HD發(fā)病中所起的重要作用，并尋找與HD相關(guān)的單倍體型。 研究方法：收集臨床確診的散發(fā)性HD患兒和正常對(duì)照兒童外周血，鹽析法提取基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(polym

8、erasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)技術(shù)，對(duì)EDNRB基因全部七個(gè)外顯子以及EDN3基因兩個(gè)外顯子進(jìn)行突變篩查，并對(duì)發(fā)現(xiàn)異常泳動(dòng)帶的樣本進(jìn)行DNA測(cè)序，以明確突變類型；應(yīng)用PCR-直接測(cè)序技術(shù)，對(duì)收集到的病例與正常對(duì)照樣本進(jìn)行RET+3、rs2506004和rs2506005位點(diǎn)的基因型分析，統(tǒng)計(jì)等位基因頻率，再運(yùn)用SHEsis軟件(http：

9、//202.120.7.14/analysis/myAnalysis.php)進(jìn)行等位基因頻率、位點(diǎn)連鎖不平衡以及單倍體頻率分析。 研究結(jié)果：在75例散發(fā)性HD中應(yīng)用PCR-SSCP分析EDNRB及EDN3基因，發(fā)現(xiàn)8例樣本具有異常泳動(dòng)條帶。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，6例患者攜帶L831L的同義突變，此突變已經(jīng)被確認(rèn)為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，人群基因頻率為0.5；2例患者攜帶V553M的錯(cuò)義突變，此突變位于蛋白的跨膜區(qū)域，國(guó)外人群研究結(jié)果中未見報(bào)

10、道，可能是中國(guó)人所特有，突變頻率為2/75(2.8％)。EDN3基因上未有突變被發(fā)現(xiàn)。 對(duì)132例正常樣本和99例散發(fā)性HD患者進(jìn)行RET+3位點(diǎn)的基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常人群以TC基因型為主，T等位基因頻率為45％，C等位基因頻率為55％；病例樣本以TT基因型為主，T等位基因頻率為72％，C等位基因頻率為28％。Rs2506005位點(diǎn)在正常人群中以CT基因型為主，C等位基因頻率為45％，T等位基因頻率為55％；病例樣本CC基因型

11、為主，C等位基因頻率為72％，T等位基因頻率為28％。Rs2506004位點(diǎn)在正常人群中以AC基因型為主，A等位基因頻率為45％，C等位基因頻率為55％；病例樣本以AA基因型為主，A等位基因頻率為72％，C等位基因頻率28％。這三個(gè)位點(diǎn)完全連鎖不平衡，構(gòu)成TCC，CTA兩種單倍體型。后者與HD相關(guān)(Fisher'sExactP=1.81×10-8，＜＜0.0001)，男性人群增加5.1倍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，女性人群增加2.1倍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。