人IL-6高親和力拮抗肽的合理設(shè)計(jì)及功能評(píng)價(jià).pdf

1、hIL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，在諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)，隨著對(duì)大量分子生物學(xué)突變實(shí)驗(yàn)和晶體衍射結(jié)果的分析，科研工作者們不僅預(yù)測(cè)出了hIL-6/hIL-6R相互作用的重要功能活性位點(diǎn)，而且還根據(jù)這些相互作用的重要功能位點(diǎn)設(shè)計(jì)出了一系列有效的針對(duì)hIL-6的拮抗劑。本研究基于hIL-6/hIL-6R復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，從理論上選定重要的功能活性位點(diǎn)(hIL-6的AB環(huán)以及螺旋-A、D的C末端)為靶標(biāo)，合理設(shè)計(jì)

2、出具有潛在功能的hIL-6拮抗肽，并選擇XG-7、M1細(xì)胞對(duì)其拮抗功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。 (1)基于hIL-6/hIL-6R復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)合理設(shè)計(jì)hIL-6拮抗肽 基于hIL-6/hIL-6R復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，從理論上確定hIL-6與hIL-6R相互作用的重要區(qū)域。以hIL-6AB環(huán)區(qū)和螺旋A、D的C末端和為靶標(biāo)，合理設(shè)計(jì)出hIL-6拮抗肽PT。理論分析結(jié)果表明，拮抗肽PT在體外能夠有效地模擬hIL-6的作用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hIL-6

3、R。 (2)hIL-6R胞外段及突變體蛋白的表達(dá)、純化、功能及拮抗肽PT競(jìng)爭(zhēng)hIL-6結(jié)合hIL-6R的評(píng)價(jià) 以eDNA-514為模板，將hIL-6R胞外段基因hIL-6R-EC05和缺失突變體hIL-6R-EC70(缺失Ig區(qū))定向克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)Ni2+鏊合柱純化，通過(guò)Westernblot進(jìn)行鑒定。ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ig區(qū)在hIL-6R中僅起到穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用，對(duì)于

4、hIL-6和hIL-6R的作用影響不大。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，拮抗肽PT在體外能夠有效地模擬hIL-6的作用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hIL-6R胞外段及其缺失突變體。 (3)選擇XG-7和M1細(xì)胞模型探討拮抗肽PT的生物學(xué)功能 ①利用細(xì)胞因子依賴株XG-7細(xì)胞(一種B細(xì)胞來(lái)源的hIL-6特異性依賴的細(xì)胞)對(duì)拮抗肽PT進(jìn)行生物學(xué)功能評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，拮抗肽PT擁有潛在的生物學(xué)活性，能有效地阻斷hIL-6的功能，誘導(dǎo)XG-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

5、、促使其凋亡并呈劑量依賴性。 ②選用白血病M1細(xì)胞(在hIL-6的作用下生長(zhǎng)會(huì)遭到抑制并誘發(fā)凋亡)為模型對(duì)拮抗肽PT進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，拮抗肽PT能有效地保護(hù)M1細(xì)胞，使其在hIL-6作用下產(chǎn)生的生長(zhǎng)增殖抑制和被誘導(dǎo)的凋亡得到一定的緩解。 總之，計(jì)算機(jī)輔助合理設(shè)計(jì)獲得的拮抗肽PT，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有一定的生物學(xué)活性，表現(xiàn)在能夠有效地阻斷hIL-6的功能，誘導(dǎo)或緩解細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和凋亡。同時(shí)，本研究中利用M1細(xì)胞模型評(píng)價(jià)