β-,2-受體的表達、純化及在快速檢測中的應用.pdf

1、β2腎上腺素能受體激動劑(β2激動劑)的非法濫用一直是畜產(chǎn)品安全問題的焦點之一。從鹽酸克侖特羅，到萊克多巴胺、齊帕特羅，再到斑布特羅，β2激動劑類藥物不斷更新。一種β2激動劑類藥物剛得到控制，又會出現(xiàn)新的藥物，畜牧生產(chǎn)中非法使用β2激動劑的現(xiàn)象屢禁不止，因畜產(chǎn)品中殘留而造成消費者中毒事件時有發(fā)生。因此，在監(jiān)控中迫切需要能夠建立β2激動劑類藥物多殘留的快速篩選檢測技術(shù)。 β2激動劑的作用機理是能夠被體內(nèi)的受體蛋白識別，并引發(fā)一系列

2、生理反應，因此β2腎上腺素能受體(β2AR)是一種可以識別各種β2激動劑的蛋白，其與β2激動劑的結(jié)合具有特異性和高親和性。 本研究利用本實驗室克隆的大倉鼠肺細胞β2AR基因分別在原核及哺乳動物細胞中進行外源表達并純化，將受體作為識別所有β2激動劑的元件代替抗體，組成受體-β2激動劑-酶反應系統(tǒng)，為β2激動劑的多殘留檢測提供研究基礎(chǔ)。 通過大腸桿菌原核細胞表達N端融合麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，C端融合組氨酸標簽(6his)

3、的β2AR重組蛋白。構(gòu)建三個原核表達載體，pMAL-p2x-β2AR(SX)，pMAL-p2x-β2AR(EX)，pMAL-p2x-β2AR(EX-62)，SX為蛋白酶穩(wěn)定型載體，EX為表達全長蛋白，EX-62為截去N端62個氨基酸的截短蛋白。經(jīng)SDS-PAGE，Westernblotting檢測融合蛋白得到表達，將表達全細胞經(jīng)放射性配基(125I標記的β拮抗劑-氰心得靜，ICYP)檢測顯示蛋白具有與ICYP結(jié)合的活性，并且這種結(jié)合活性

4、被β2激動劑特異性抑制。用檢測克侖特羅的ELISA試劑盒測定三種表達菌液的中帶有的活性蛋白濃度分別為：1.29pmol/L，2.06pmol/L，0.99pmol/L。 為了提高蛋白活性及表達量，在哺乳動物細胞中表達融合綠色熒光蛋白(GFP)的重組蛋白。表達細胞選擇人胚胎腎細胞HEK293，分別建立自表達及誘導表達系統(tǒng)。構(gòu)建自表達載體pCDNA3.1＋-β2AR-GFP，N端融合6His標簽，C端融合GFP蛋白，瞬時轉(zhuǎn)染HEK2

5、93細胞，可以檢測到蛋白表達，融合蛋白具有綠色熒光性，并經(jīng)SDS-PAGE，Westernblotting檢測有特異性蛋白表達。但是無法篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。為了獲得穩(wěn)定表達β2AR的穩(wěn)定細胞株，建立四環(huán)素誘導的表達系統(tǒng)。篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細胞，擴大培養(yǎng)后，加入四環(huán)素1μg/mL誘導蛋白表達。經(jīng)放射性配基ICYP檢測顯示其具有與ICYP結(jié)合的活性，并且這種活性被β2激動劑特異性抑制。 為了進一步提高蛋白的表達量，經(jīng)過受體蛋白疏水性分

6、析，根據(jù)蛋白的立體結(jié)構(gòu)，在不影響β2激動劑結(jié)合的位點，將疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸。用套疊PCR法進行基因突變，構(gòu)建兩個突變體：突變體一分別對七個跨膜域氨基酸進行突變，突變體二將二，四，六位氨基酸進行突變。構(gòu)建突變原核表達載體pMAL-p2x-β2AR1，pMAL-p2x-β2AR2，并對蛋白的原核表達進行初步研究。 蛋白純化方面，細胞經(jīng)多次超速離心后，使用非離子去垢劑將受體蛋白從細胞膜上解離，原核細胞表達蛋白經(jīng)Amalso親和

7、柱純化，哺乳動物細胞表達蛋白經(jīng)鎳柱純化，獲得純化的β2AR蛋白。原核表達蛋白1L培養(yǎng)基中純化受體量為0.198mg，約占粗膜蛋白的1.67％；哺乳動物細胞從四板細胞培養(yǎng)瓶(15cm)中純化受體量為0.135mg，約占膜蛋白的3.8％，結(jié)果顯示哺乳動物表達的受體蛋白比例高于大腸桿菌表達。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting檢測，純化后的融合蛋白具有特異結(jié)合抗體的能力。使用斑點-ELISA及斑點-酶聯(lián)配基法，對純化后β2AR蛋

8、白的配基結(jié)合活性進行檢測，表明粗膜蛋白及純化蛋白保持與克侖特羅等三種β2激動劑特異性結(jié)合的活性，且β2AR蛋白與β2激動劑結(jié)合量呈現(xiàn)S型濃度依賴曲線。 分別將表達細胞的粗膜蛋白和純化β2AR受體包被于96孔聚苯乙烯板，以辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的克侖特羅和游離的克侖特羅，萊克多巴胺及沙丁胺醇構(gòu)成競爭型檢測試劑盒，進行β2激動劑的多殘留檢測。隨著游離克侖特羅等β2激動劑濃度的增加，HRP的酶促顯色反應明顯得到抑制，而對照組蛋白

9、則無此反應。測定克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇對粗膜蛋白及純化蛋白的IC50值，說明β2AR受體對不同β2激動劑都有親和性，但是對克侖特羅的親和力最強。尿樣添加回收實驗中，空白尿樣添加濃度分別為1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL.，同時用受體包被酶標板及ELISA試劑盒檢測，在受體包被板中添加濃度為1ng/mL時平均回收率僅達到40％，添加濃度為高濃度時(10ng/mL，100ng/mL)回收率達到70％左右，ELISA試劑