Myole表達(dá)變化對小鼠腎小球足細(xì)胞形態(tài)及功能變化的影響.pdf

1、研究背景
　　 近年來的研究表明，腎小球上皮細(xì)胞足突（Foot processes，F(xiàn)P）及相鄰足突間的裂孔隔膜（Slit diaphragm，SD）是保持腎小球濾過膜生理屏障功能的最重要結(jié)構(gòu)。上皮細(xì)胞特殊結(jié)構(gòu)的維持主要依賴于以肌動蛋白為主的細(xì)胞骨架系統(tǒng)（actin細(xì)胞骨架）和足突中表達(dá)的特異性蛋白分子（足突分子）。自1998年以來，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個表達(dá)在腎小球上皮細(xì)胞足突及裂孔隔膜的分子，在維持腎小球發(fā)育、濾過膜完整性、足細(xì)胞

2、信號分子傳導(dǎo)、防止蛋白尿漏出等方面起著非常重要的作用。足細(xì)胞通過調(diào)整自身形態(tài)，改變細(xì)胞之間的濾過間隙從而適應(yīng)腎小球濾過容積的改變，這一功能的完成依賴于足細(xì)胞強大的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，而Ⅰ型肌球蛋白的功能與actin細(xì)胞骨架密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，MyosinⅠ類分子中的Myole，當(dāng)其表達(dá)下調(diào)后，實驗動物斑馬魚出現(xiàn)水腫（pericardial edema）、腎小球局部細(xì)胞數(shù)量減少及pronephric cyst、以及前腎小管和前腎導(dǎo)管管腔、上

3、皮細(xì)胞胞體內(nèi)吞體（類似于人類腎小球疾病時的蛋白尿）等改變。Myole基因敲除的小鼠出現(xiàn)了蛋白尿以及慢性腎損害，超微結(jié)構(gòu)顯示腎小球基底膜增厚，上皮細(xì)胞足突融合等改變，表明Myole對足細(xì)胞和腎小球濾過膜的功能完整性確實是必需的。但是目前并沒有從細(xì)胞分子水平研究Myole敲低后對足細(xì)胞功能的影響及其相關(guān)機制機制。
　　 目的
　　 探討Myole表達(dá)敲低后腎小球足細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的變化。闡明Myole蛋白在維持足突結(jié)構(gòu)

4、及腎小球濾過屏障中可能所起的作用，及其與細(xì)胞骨架F--ctin之間的相互作用機制。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)：將小鼠足細(xì)胞系 MPC5細(xì)胞株進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，在33℃、γ-干擾素條件下增殖培養(yǎng)，37℃分化成熟。通過免疫熒光的方法用足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子Nephrin，CD2AP鑒定足細(xì)胞。
　　 2、免疫熒光方法檢測Myole及F-actin蛋白在足細(xì)胞不同狀態(tài)下的分布及表達(dá)情況。
　　 3、根據(jù) San

5、ta Cruz公司提供的試劑及實驗方法對足細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染敲低myole實驗，并且設(shè)立 control組及 Scrambled negative control。
　　 4、用實時熒光定量方法從 mRNA水平檢測干擾效果，以β-actin作為內(nèi)參，并且檢測了 Myole與β-actin擴增效率的一致性，相對定量方法分析表達(dá)差異。
　　 5、用 Western-Blot方法從蛋白水平檢測 myole的干擾效果。以β-act

6、in作為內(nèi)參，經(jīng)過Image j軟件對灰度進(jìn)行分析，半定量分析蛋白表達(dá)水平。
　　 6、免疫熒光的方法觀察 myole干擾后及足細(xì)胞形態(tài)學(xué)所發(fā)生的改變。
　　 7、免疫熒光的方法檢測 myole干擾后F-actin的結(jié)構(gòu)變化。
　　 8、用MTT細(xì)胞增殖法檢測不同處理組細(xì)胞增殖能力，共設(shè)6個時間點檢測MTT的OD值，分別為24h、48h、72h、96h、120h、144h。
　　 9、不同處理組小鼠足細(xì)胞

7、靜默處理后，分別利用 Transwell小室在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，評估細(xì)胞的遷移情況。
　　 10、不同處理組細(xì)胞經(jīng)過50μg/ml的PAN（嘌呤霉素氨基核苷）處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，計數(shù)貼壁的細(xì)胞，統(tǒng)計分析。
　　 11、不同處理組細(xì)胞消化后以相同的密度重新接種于六孔板中，37℃孵育1小時后，倒掉培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，對細(xì)胞黏附能力進(jìn)行評估。
　　 12、不同處理組細(xì)胞用 FITC-Transferrin于

8、37℃條件下孵育5小時，PBS洗滌后觀察細(xì)胞內(nèi)吞FITC-Transferrin的陽性率，從而檢測細(xì)胞的內(nèi)吞能力。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同狀態(tài)下的細(xì)胞形狀及足細(xì)胞鑒定：增殖狀態(tài)的細(xì)胞多呈梭形、多邊形，細(xì)胞核圓形，位于細(xì)胞中央，足突較短較粗較少。分化成熟的足細(xì)胞細(xì)胞形狀不規(guī)則，胞體大，胞漿豐富，核圓形，位于細(xì)胞中央。足突較長較細(xì)較多，有些足突末梢還會分出樹突狀的分又。Nephrin及CD2AP作為鑒定足細(xì)胞的蛋白分子

9、，可見足細(xì)胞內(nèi)有明顯特異的表達(dá)。
　　 2、在未分化的足細(xì)胞中，Myole主要集中分布在核周及細(xì)胞主要突起的近核部，F(xiàn)-actin在胞漿沿細(xì)胞長軸向細(xì)胞主突起分布，在非許可條件下分化2周后，足細(xì)胞內(nèi)的Myole熒光點狀散布于胞漿，且向周邊聚集，次級突起熒光染色明顯，F(xiàn)-actin在分化中足細(xì)胞內(nèi)呈放射狀分布，蛋白絲伸展到細(xì)胞周邊新形成的足突內(nèi)。
　　 3、實時熒光定量方法從 mRNA水平檢測干擾效果：實驗表明目的基因My

10、ole和內(nèi)參基因β-actin的擴增效率近似相等，故可用相對定量分析法來分析目的基因的改變量，得出如下結(jié)果：亂序陰性對照組 myole的表達(dá)量是對照組的0.857±～0.154倍；干擾組 myole的表達(dá)量是對照組的0.250±～0.0892倍；亂序?qū)φ战M與對照組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），而干擾組與對照組及亂序?qū)φ战M間均有明顯的差異（P<0.01）。Western-Blot法半定量分析對照組 myole/β-actin的比值

11、1.638±～0.061；亂序陰性對照組比值為1.547±～0.050；干擾組為0.851±0.0421；通過單因素方差分析檢驗，陰性對照與對照組之間無明顯差異，干擾組與對照組細(xì)胞之間有顯著差異，P值<0.01。
　　 4、Myole基因干擾后足細(xì)胞形態(tài)的變化：干擾后的細(xì)胞可見細(xì)胞胞體縮小，邊緣不整，細(xì)胞足突的融合，細(xì)胞增殖緩慢。
　　 5、細(xì)胞干擾后骨架蛋白 F-actin的變化：對照組及亂序陰性對照組的足細(xì)胞具有大量

12、平行排列的較細(xì)的彈力蛋白絲（F-actin），擴展橫跨整個細(xì)胞。而干擾組細(xì)胞，大量的彈力蛋白絲消失，但可見非常亮的具刻點形狀的肌動蛋白凝聚物。（×200）
　　 6、細(xì)胞功能的變化：
　　 ①MTT檢測細(xì)胞增殖實驗，計算每組的 MTT OD值，對照組與陰性對照組數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)配對t檢驗，p<0.01，兩組間具有明顯差異，對照組與干擾組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)配對t檢驗，p<0.01，故具有統(tǒng)計學(xué)意義。陰性對照與干擾組之間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)配

13、對t檢驗，p<0.01，兩者間差異明顯。并且計算 Scrambled negative control組與干擾組的細(xì)胞抑制率，陰性對照細(xì)胞生長抑制率不明顯，而干擾組細(xì)胞在每個時間點的抑制率明顯。通過統(tǒng)計學(xué)分析，配對t檢驗，p<0.01，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 ②足細(xì)胞體外 Transwell遷移實驗，在200倍顯微鏡下計數(shù) Transwell膜底面的遷移細(xì)胞（圖15），對照組細(xì)胞數(shù)為84.67±10.94個，陰性對照組遷移細(xì)胞數(shù)

14、為82.33±9.07，干擾組遷移細(xì)胞數(shù)為26.14±4.30個，經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)陰性對照組與對照組之間P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異；而干擾組與對照組P<0.01，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異；干擾組與陰性對照組相比，P<0.01，亦具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 ③足細(xì)胞黏附實驗：，37℃孵箱孵育1小時，計數(shù)貼壁細(xì)胞。結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞的黏附能力明顯減弱，在200倍顯微鏡下計數(shù)六孔板上的貼壁細(xì)胞，對照組貼壁細(xì)胞數(shù)為對照組細(xì)胞數(shù)為132

15、.17±19.64個，亂序陰性對照組貼壁細(xì)胞數(shù)為123.17±12.98；干擾組貼壁細(xì)胞數(shù)85.17±7.73個，亂序陰性對照組與對照組相比并無明顯差異，P>0.05，而干擾組與對照組之比，P<0.01，兩組間具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 ④足細(xì)胞分離實驗，不同處理組的足細(xì)胞用高濃度的 PAN作用48后，產(chǎn)生急性損傷，從培養(yǎng)瓶上脫落，將為脫落的細(xì)胞經(jīng)過多聚甲醛固定后，用結(jié)晶紫染色計數(shù)細(xì)胞數(shù)，觀察細(xì)胞形態(tài)，對照組貼壁細(xì)胞數(shù)為對照組細(xì)

16、胞數(shù)為104.50±6.02個，亂序陰性對照組貼壁細(xì)胞數(shù)為99.00±6.13；干擾組貼壁細(xì)胞數(shù)71.00±18.45個，亂序陰性對照組與對照組相比并無明顯差異，P>0.05，而干擾組與對照組之比，P<0.01，兩組間具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 ⑤足細(xì)胞內(nèi)吞作用檢測，免疫熒光結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞內(nèi)吞作用明顯減弱，們還計數(shù)了每組至少100多個細(xì)胞，計算出轉(zhuǎn)鐵蛋白陽性的細(xì)胞率，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，control組陽性率94.32±1.82

17、5％，Scrambled negative control組陽性率91.10±4.243％，干擾組細(xì)胞23.81±3.564％，干擾組與對照組間P<0.01，具有明顯差異，亂序陰性對照和對照組間P>0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、myosinle在不同時期的細(xì)胞中分布不同，故其可能參與了足突的形成過程。
　　 2、myosinle在維持細(xì)胞形態(tài)方面發(fā)揮重要的作用。
　　 3、myosinle可能通過影