環(huán)氧合酶-2在非酒精性脂肪性肝炎中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的： 非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一種遺傳．環(huán)境．代謝相關(guān)性疾病，是以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性和炎癥為特征的臨床病理綜合征。近年來，隨著人們生活水平的提高，NASH的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡趨于年輕化。目前，NASH不再被認(rèn)為是一種良性病變，而被認(rèn)為是嚴(yán)重肝病的前兆，是引起脂肪性肝硬化的重要原因之一。對(duì)于NASH的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，而在治療上也無有效的方法。環(huán)氧合

2、酶(cyclooxygenase，COX)是體內(nèi)催化花生四烯酸分解為前列腺素(prostaglandins，PGs)的關(guān)鍵酶。在人體內(nèi)，COX主要有二種類型：既結(jié)構(gòu)型COX—1和誘導(dǎo)型COX-2。COX-2是迅速短暫的早期即刻基因，呈誘導(dǎo)型表達(dá)，即正常生理狀態(tài)下在多數(shù)組織中不表達(dá)，而當(dāng)受到包括有絲分裂原、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、細(xì)菌內(nèi)毒素等刺激因素作用時(shí)，其表達(dá)迅速上調(diào)。COX-2及其代謝產(chǎn)物PGs參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成等多種

3、病理生理過程。但COX-2在NASH中的表達(dá)及作用機(jī)制目前研究甚少。本研究的目的旨在應(yīng)用高脂飲食制備NASH大鼠模型，以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR) 及免疫組織化學(xué)染色(immunohistachemistry staining)的方法觀察COX-2 mRNA及COX-2蛋白在NASH模型大鼠肝組織中的表達(dá)情況，以探討COX-2在N

4、ASH發(fā)病機(jī)制中的表達(dá)及意義，為有效防治NASH提供一條新思路。 方法： 選用健康雄性Wistar大鼠16只，體重140±10g，隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照組8只：以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)；模型組8只：以高脂飼料(2％膽固醇+10％豬油+5％玉米油)喂養(yǎng)，于16周末處死全部大鼠。留取標(biāo)本用于以下項(xiàng)目檢測：日本Olympus AU 2700全自動(dòng)生化分析儀測定血清膽固醇(cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerid

5、e，TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)。酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平。蘇木精.伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察肝組織普通病理改變，Sud

6、an Ⅳ染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度。免疫組織化學(xué)SP法及RT-PCR分別檢測COX-2蛋白和COX-2mRNA在大鼠肝臟中的表達(dá)情況。凝膠電泳遷移率改變分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)檢測肝組織核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclear factor-kB，NF-kB)的活性變化。 結(jié)果： 1.血清生化指標(biāo)變化：模型組大鼠血清TC、TG、ALT、AST、TNF-α水平分別為

7、(2.95±0.32，0.88±0.17，96.63±14.16，156.13±14.74，48.23±3.38)明顯高于正常組(1.80±0.22，0.51±0.16，39.50±12.19，71.25±14.40，1.74±1.30)(p<0.01)。 2.肝臟的病理學(xué)變化：肉眼下觀察，正常大鼠肝臟呈紅褐色，明亮有光澤。模型組大鼠肝臟腫大，邊緣鈍，呈淺黃色或土黃色，切面油膩，可見局灶性黃白相間灶。16周末，光鏡下可見，正常組

8、大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列；模型組大鼠肝細(xì)胞中均出現(xiàn)中、重度的脂肪變性，伴有小葉內(nèi)炎癥，及點(diǎn)狀或灶性壞死。大部分出現(xiàn)匯管區(qū)擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤。 3.免疫組化法檢測大鼠肝組織COX-2蛋白的表達(dá)：光鏡下，正常組大鼠肝臟內(nèi)無COX-2蛋白的表達(dá)。模型組大鼠肝細(xì)胞及肥大的枯否細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色的顆粒。每張切片均取四周及中央五個(gè)四野，采用病理圖像分析儀分析COX-2在肝臟中的表達(dá)量。結(jié)果：模型組大鼠肝組織COX-2的表達(dá)量(

9、0.846±0.051)明顯高于正常組(p<0.01)。 4.RT-PCR法檢測COX-2 mRNA的表達(dá)量：正常組大鼠肝組織中COX-2 mRNA無表達(dá)，模型組COX-2 mRNA表達(dá)增高(0.854±0.025)，二者比較有顯著性差異(p<0.01)。 5.EMSA檢測大鼠肝組織NF-kB活性：高脂組NF-kB活性(10.12±1.34)高于正常對(duì)照組(1.58±1.23)(。19<0.05)。 結(jié)論：

10、 1 應(yīng)用高脂飲食可以成功復(fù)制NASH大鼠模型，NASH大鼠血清TNF-α水平明顯升高，TNF-α可誘導(dǎo)NF-kB的活化，進(jìn)而導(dǎo)致COX-2表達(dá)升高，同時(shí)，COX-2的表達(dá)又可誘導(dǎo)以TNF-α為代表的細(xì)胞因子釋放增加，這些因素共同參與NASH的發(fā)生發(fā)展。 2 COX-2在NASH大鼠肝組織表達(dá)明顯增高，高表達(dá)的COX-2不僅可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，而且可誘導(dǎo)炎癥因子釋放?？傊?，COX-2在NASH大鼠肝組織脂質(zhì)沉積-炎癥反應(yīng)介質(zhì)