過氧化物酶體增殖物活化受體gamma在大鼠放射性心臟損傷中的表達(dá)研究.pdf

1、前言:放療(RT)對于部分腫瘤來說，如乳腺癌、食道癌、肺癌、縱隔腫瘤等，是一種較為有效的治療手段，但在照射過程中無法避免照射到心臟組織。過去人們認(rèn)為心臟是抗輻射性較強(qiáng)的器官，對放射線具有較高的抵抗力和耐受性。但近年來的臨床實(shí)踐表明胸部放射治療法會引起放射性心臟損傷，尤其是隨著胸部腫瘤放療技術(shù)的推廣和大劑量放療的廣泛應(yīng)用，腫瘤患者的生存期延長的同時(shí)，放療所致的心臟損傷，特別是遲發(fā)性心臟損傷問題更加突出。對于如何預(yù)防及治療放射性心臟損傷的研

2、究也逐漸成為熱點(diǎn)。PPAR-γ已被證明存在于心肌組織中，并且參與了多種心臟疾病的形成，其激活劑對心臟也有一定的保護(hù)作用，但是在放射性心臟損傷中PPAR-γ的表達(dá)在國內(nèi)外幾乎沒有相關(guān)研究，故本實(shí)驗(yàn)通過以大鼠為研究對象，探討PPAR-γ在放射性心臟損傷中的表達(dá)情況，并測定下游蛋白的表達(dá)情況，探討PPAR-γ在放射性心臟損傷形成中的作用。
　　 材料與方法:
　　 一、材料
　　 1、實(shí)驗(yàn)對象
　　 以SPF級

3、SD大鼠為研究對象，雌雄各半，月齡3個(gè)月，體重約170-210g，購置中國醫(yī)科大學(xué)動物中心。
　　 2、主要的實(shí)驗(yàn)試劑PPAR-γ、MMP-1、TIMP-1、TGF-β1第一抗體購置于美國Santa Cruz公司，其余試劑及耗材購至于北京中衫金橋生物有限公司及北京尚柏生物有限公司。PPAR-γ Real-time PCR試劑盒購置于日本Takara公司（大連寶生物代理）。
　　 二、方法
　　 1、建立動物模型共

4、40只SD大鼠，隨機(jī)將大鼠分為3組，1組不接受任何干預(yù)，其余2組分別用6Mv高能X射線照射心臟，劑量分別為15Gy和18Gy。照射后飼養(yǎng)3個(gè)月后，以水合氯醛過量麻醉法處死大鼠，取其心臟組織。將心臟組織橫斷，一部分固定于4％的中性甲醛溶液中，一部分放置于-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>　　 2、心肌組織HE染色及Masson染色將固定好的心臟組織修材、脫水、透明、包埋制成蠟塊。切片做常規(guī)HE染色，及Masson染色，顯微鏡下觀察心臟組織

5、在照射后的改變情況。
　　 3、免疫組織化學(xué)染色將蠟塊切片做PPAR-γ的免疫組化染色，顯微鏡下觀察PPAR-γ及大致的表達(dá)情況及通過計(jì)算機(jī)測定其平均光密度值。
　　 4、Western blot分析利用儲存-80℃冰箱中的組織做Western blot，測定PPAR-γ、MMP-1、TIMP-1以及TGF-β1蛋白的表達(dá)情況。
　　 5、Real-time PCR利用儲存-80℃冰箱中的組織做Real-time

6、 PCR，測定PPAR-γ mRNA的表達(dá)情況，在分子水平證明其表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 一、動物模型建立情況
　　 完成全部實(shí)驗(yàn)存活的大鼠共29只。對照組8只，15Gy照射組11只，18Gy照射組10只。
　　 二、心肌病理結(jié)果
　　 1、HE染色鏡下觀察照射組心肌細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)變性及壞死，細(xì)胞核排列不規(guī)則，對照組心肌細(xì)胞排列正常。
　　 2、Masson染色鏡下觀察可見照

7、射組心肌內(nèi)膠原組織明顯增多，粗大膠原及纖維相互連接成網(wǎng)狀，排列紊亂，分布不勻，緊密圍繞于心肌細(xì)胞周圍及小血管周圍。對照組未見明顯改變。
　　 三、PPAR-γ蛋白表達(dá)免疫組化
　　 鏡下觀察可見實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟組織的心肌細(xì)胞、及血管內(nèi)皮中PPAR．γ大量表達(dá)，對照組稍有表達(dá)。通過計(jì)算機(jī)測定其灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后實(shí)驗(yàn)組與對照組表達(dá)差異明顯。western blot分析通過測定蛋白灰度值與用作內(nèi)參的β-actin灰度值的比

8、值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后照射組心肌中PPAR-γ蛋白表達(dá)較對照組明顯增高。
　　 四、PPAR-γmRNA表達(dá)
　　 擴(kuò)增后測定內(nèi)參(β-actin)和目的基因的Ct值，通過2-ΔΔct法計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組與對照組相比PPAR-γmRNA擴(kuò)增明顯。
　　 五、MMP-1、TIMP-1、TGF-β1蛋白表達(dá)
　　 MMP-1蛋白表達(dá)在3組間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，TIMP-1及TGF-β1蛋白表達(dá)在15Gy及1