基因修飾干細(xì)胞和封堵器在胸科中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分納米載體轉(zhuǎn)染VEGF基因修飾干細(xì)胞移植治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 1制備VEGF165基因納米載體復(fù)合物并觀察其一般性狀。 2建立并優(yōu)化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)的分離培養(yǎng)方案；觀察MSCs體外培養(yǎng)特點(diǎn)和生物學(xué)特性。 3觀察納米載體介導(dǎo)的VEGF165基因轉(zhuǎn)染大鼠MSCs后，細(xì)胞內(nèi)VEGF165表達(dá)情況及納米粒子VEGF165對(duì)MSCs生長(zhǎng)的

2、影響。 4研究納米載體介導(dǎo)VEGF165基因修飾后的MSCs移植于梗死心肌后的成血管作用和心功能改善程度。 方法： 1制備VEGF165基因納米載體復(fù)合物及鑒定運(yùn)用鼠源pcDNA3.1/VEGF165質(zhì)粒，采用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)納米粒子作為基因載體，采用復(fù)乳化溶劑揮干法制備載VEGF165基因納米粒子，研究載VEGF165納米載體復(fù)合物的處方和制備工藝并進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其包括粒徑、包封率、含藥量、體外釋

3、藥等藥劑理化性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。 2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性分析Percoll法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁法培養(yǎng)，2.5ml/L胰酶消化傳代培養(yǎng)MSCs。檢測(cè)MSCs的CD31、CD44、CD45和CD90的表達(dá)，鑒定MSCs的相對(duì)純度；倒置相差顯微鏡和HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，繪制原代和傳代MSCs的生長(zhǎng)曲線。對(duì)MSCs進(jìn)行4，6二氨基-2-苯茚二酮(4，6 di

4、amidino-2-phenyl indole，DAPI)染色。 3納米載體介導(dǎo)的VEGF165基因轉(zhuǎn)染大鼠MSCs及轉(zhuǎn)染后相關(guān)表現(xiàn)培養(yǎng)MSCs，傳代后按2×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種于24孔板中，培養(yǎng)48h，使達(dá)到60％融合。于6個(gè)孔中加入VEGF 165基因納米粒子；6個(gè)孔中加入VEGFl65裸質(zhì)粒；6個(gè)孔為空白對(duì)照組，培養(yǎng)24 h。應(yīng)用RT PCR法檢測(cè)VEGF mRNA水平，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)水平，觀察納米

5、基因載體為真核細(xì)胞傳遞基因的可行性。 4納米載體介導(dǎo)VEGF165基因修飾后的MSCs移植治療心肌梗死建立心肌梗死模型。體外轉(zhuǎn)染MSCs并DAPI標(biāo)記。各組大鼠結(jié)扎30min后，心肌梗死部位分別注射納米粒子介導(dǎo)VEGF165基因轉(zhuǎn)染的MSCs；MSCs懸液；VEGF165基因納米載體懸液和無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。移植后4w檢測(cè)各組動(dòng)物心功能和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，免疫熒光顯微鏡下觀察DAPI熒光表達(dá)情況，免疫組化方法檢測(cè)Ⅷ在血管內(nèi)皮的表

6、達(dá)，測(cè)定微血管密度。 結(jié)果： 1成功制備VEGF165基因納米粒子(1)包封率為：89.3％；(2)載藥率為：1.94％；(3)電鏡觀察納米粒子的粒徑在75～310nm之間。 2.MSCs細(xì)胞生長(zhǎng)良好Percoll分離法可得到純度達(dá)90％的MSCs，MSCs細(xì)胞呈漩渦樣生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)中形態(tài)和特性無(wú)明顯變化，均質(zhì)性逐步提高，具有活躍的倍增能力。DAPI對(duì)MSCs對(duì)標(biāo)記率達(dá)100％。 3納米載體介導(dǎo)的鼠源VE

7、GF165基因可體外轉(zhuǎn)染大鼠MSCsELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，納米粒子組的細(xì)胞上清中VEGF蛋白質(zhì)量濃度為167.2±17.8mg/l，顯著高于裸質(zhì)粒組與空白對(duì)照組。RT-PCR結(jié)果顯示納米粒子組可見(jiàn)特異性條帶，裸質(zhì)粒組、對(duì)照組無(wú)此特異性條帶，這說(shuō)明納米載體可將VEGF基因?qū)隡SCs。 4納米載體介導(dǎo)VEGF165基因外轉(zhuǎn)染的MSCs治療心肌梗死的療效術(shù)后4w，與MSCs組、NP/VEGF165組和Control組相比較，MS

8、Cs/NP/VEGF165組大鼠心功能和血流動(dòng)力學(xué)顯著改善；MSCs/NP/VEGF165組大鼠心肌梗死區(qū)微血管密度亦顯著高于其他3組。 結(jié)論： 1成功地構(gòu)建VEGF165基因納米載體。 2建立了可行的大鼠MSCs分離培養(yǎng)方案。 3證實(shí)納米載體介導(dǎo)的VEGF165基因轉(zhuǎn)染大鼠MSCs是可行的。 4納米載體和VEGF165基因治療聯(lián)合MSCs移植是治療心肌梗死的有效方法，所產(chǎn)生的協(xié)同治療效果大于單純

9、VEGF165基因治療或單純MSCs移植。 第二部分 雙傘形封堵器治療支氣管殘端瘺的應(yīng)用研究 目的： 初步探討利用鎳鈦記憶合金編織的自膨式雙傘形覆膜封堵器介入治療全肺切除術(shù)后并發(fā)支氣管殘端瘺的可行性。 方法： 2002.4-2006.11期間在我院6例接受全肺切除術(shù)，術(shù)后并發(fā)支氣管殘端瘺。運(yùn)用雙傘形封堵器閉合瘺口，術(shù)后隨訪4個(gè)月～4年。 結(jié)果： 所有病例都封堵成功