電針扶突穴等對頸部切口痛大鼠頸髓GABA-Glu受體-cAMP-CREB信號通路活動的影響.pdf

1、研究背景:
　　針灸是祖國醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在治療各種病痛方面療效顯著。臨床上利用針灸的鎮(zhèn)痛作用，可有效地進(jìn)行急性痛、慢性痛、癌痛等的治療，并開展了多種多樣的外科手術(shù)和術(shù)后疼痛的治療。甲狀腺于術(shù)是針刺麻醉最佳適應(yīng)證之一。術(shù)后痛是急性疼痛的一種表現(xiàn)形式，臨床上，針刺能夠緩解多種術(shù)后切口痛，減輕病人痛苦，促進(jìn)康復(fù)，減少術(shù)后惡心嘔吐，改善于術(shù)預(yù)后。動物實(shí)驗(yàn)也證明，電針可減輕大鼠足底切口痛行為反應(yīng)。但是，針刺緩解頸部術(shù)后切口痛的作用機(jī)制

2、還不清楚，研究報道鮮見。脊髓是痛覺信息進(jìn)入中樞后的第一級整合中樞，脊髓背角，尤其是背角淺層，含有種類繁多的神經(jīng)活性物質(zhì)和受體，在脊髓水甲的痛信息傳遞、整合及痛覺調(diào)制中扮演著重要的角色。我們前期的研究工作證明：甲狀腺區(qū)手術(shù)切口后4-6小時的疼痛反應(yīng)，電針扶突、合谷-內(nèi)關(guān)穴區(qū)對具有較佳的鎮(zhèn)痛效應(yīng)；該鎮(zhèn)痛效果與其下調(diào)頸段脊髓背的致痛物質(zhì)P物質(zhì)(SP)及其受體NK1基因及蛋白的表達(dá)，降鈣基因相關(guān)肽(CGRP)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)鎮(zhèn)痛物質(zhì)5羥色胺受體

3、亞型(5-HT1AR、5-HT2AR)基因、蛋白的活動實(shí)現(xiàn)的。因此，本研究擬進(jìn)一步觀察頸部切口痛大鼠疼痛行為變化的規(guī)律，觀察電針“扶突”穴區(qū)等對該切口痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的情況下，頸段脊髓內(nèi)興奮性氨基酸受體N-甲基-D-天冬氨酸受體業(yè)型2B(N-methyl D-aspartate receptor subtype2B，NMDAR2B)、代謝型谷氨酸受體業(yè)型5(metabotropic glutamate receptor subtype5，

4、mGluR5)、抑制性氨基酸γ-氨基丁酸B1受體(γ-aminobutyric acid B1receptor，GABAB1R)、細(xì)胞內(nèi)腺苷-3’，5’-環(huán)化-磷酸(cyclic Adenosinemonophosphate，cAMP)/促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPK)/環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element bindingprotein，

5、CREB)信號通路活動(表達(dá))的變化，探討電針緩解頸部切口痛的脊髓機(jī)制，為臨床針麻行甲狀腺手術(shù)、針刺治療術(shù)后痛提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法:
　　雄性Wistar大鼠122只，隨機(jī)分為正常對照(n=22)，模型組(n=34)，扶突穴組(n=22)，合谷-內(nèi)關(guān)組(n=22)，足三里一陽陵泉組(n=22)。異氟烷麻醉下，于大鼠頸部做一長約1.5cm縱形切口，復(fù)制切口疼痛模型。各治療組在造模4 h、24 h、48 h后給予電針上

6、述諸穴區(qū)各30 min(2/15Hz，15min，1mA；15min，2mA)，用熱輻射法分別在術(shù)前、術(shù)后4h、24h、48h電針前后照射大鼠頸部/切口引起的躲避潛伏期作為衡量動物痛反應(yīng)的閾值(每組8例)。在麻醉狀態(tài)下，取C1～C4段脊髓背側(cè)部分的組織液氮研磨提取RNA和蛋白，用熒光定量RT-PCR法和Western blot方法檢測大鼠頸部C1～C4段脊髓背側(cè)等區(qū)域組織細(xì)胞膜興奮性氨基酸和抑制性氨基酸受體基因及蛋白(mGluR5 mR

7、NA、mGluR5蛋白、NMDAR2B蛋白和GABAB1R蛋白)水平的表達(dá)變化及細(xì)胞內(nèi)激酶/核轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平和蛋白水平(cAMP mRNA/MAPK mRNA/CREB mRNA和CREB蛋白、p-CREB蛋白)的變化趨勢檢測觀察，更深入地分析電針鎮(zhèn)痛行甲狀腺手術(shù)的分子生物學(xué)機(jī)制。其中RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測相應(yīng)物質(zhì)基因水平的變化(每組樣品8例)，Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測相應(yīng)物質(zhì)蛋白水平的變化(每組樣品6例)。

8、　　結(jié)果:
　　1電針扶突穴等緩解頸部切口創(chuàng)傷大鼠痛行為反應(yīng)的效應(yīng)
　　與頸部切口術(shù)前痛閾(模型組17.80±1.52 sec，扶突穴組17.88±1.89 sec，合谷-內(nèi)關(guān)組18.77±3.22 sec，足三里陽陵泉組17.63±2.18 sec)比較，甲狀腺區(qū)切口術(shù)后模型組動物的躲避潛伏期(模型組11.29±0.99sec，扶突穴組11.45±2.02sec，合谷-內(nèi)關(guān)組12.01±1.38sec，足三里陽陵泉組11.

9、2±1.72sec)明顯縮短(P<0.05)，痛閾降低。與同時期模型組比(術(shù)后4 h：11.12±1.00sec，術(shù)后1 d：11.64±0.97sec，術(shù)后2 d：11.68±1.40sec)，電針扶突穴(16.7±1.97sec，17.76±1.94sec，16.98±1.84sec)、合谷-內(nèi)關(guān)組(17.3±2.1sec，18.15±1.28sec，17.91±2.31sec)動物的痛閾明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而

10、電針足三里-陽陵泉組的痛閾值(12.15±2.53sec，11.98±1.72sec，12.18±1.79sec)未見明顯變化(P>0.05)。
　　2電針對術(shù)后48h頸部切口痛大鼠頸髓GABA/Glu受體表達(dá)的影響
　　熒光定量Real Time-PCR結(jié)果顯示，頸部切口術(shù)后，與正常對照組比較(0.56±0.04)，模型組動物脊髓背側(cè)mGluR5 mRNA表達(dá)量(1.01±0.01)顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，

11、電針扶突穴組mGluR5 mRNA的表達(dá)量(0.83±0.17)輕度降低(P>0.05)，但是比電針合谷-內(nèi)關(guān)組(1.04±0.13)、足三里-陽陵泉組(1.03±0.05)作用明顯(P<0.05)；電針足三里-陽陵泉穴，合谷-內(nèi)關(guān)組頸髓背側(cè)mGluR mRNA的表達(dá)量變化不大(P>0.05)。
　　Western blot結(jié)果顯示：頸部切口術(shù)后，模型組mGluR5蛋白表達(dá)量(1.43±0.04)比正常組(0.98±0.04)明顯

12、增多(P<0.05)。電針各組mGluR蛋白的表達(dá)量(1.22±0.04，1.06±0.04，1.14±0.04)均明顯降低(P<0.05)。模型組NMDAR2B蛋白表達(dá)量(0.46±0.04)比正常對照組(0.44±0.04)增多，但未達(dá)顯著差異(P>0.05)；電針各組基本沒明顯變化(0.41±0.03，0.45±0.04，0.43±0.05)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。
　　頸部切口術(shù)后，與正常對照組(0.64±

13、0.15)比較，模型組GABAB1R蛋白表達(dá)量(0.56±0.01)降低，針刺扶突穴組GABAB1R蛋白表達(dá)量(0.61±0.03)增多，針刺合谷-內(nèi)關(guān)組，足三里-陽陵泉組(0.54±0.04，0.56±0.05)基本沒變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。
　　3電針對術(shù)后48h頸部切口痛大鼠頸髓背角細(xì)胞內(nèi)cAMP/MAPK/CREB信號通路活動的影響
　　術(shù)后，與正常組比(0.21±0.06，0.54±0.11)，

14、模型組頸髓背側(cè)cAMP mRNA、CREBmRNA表達(dá)量(0.53±0.11，3.32±0.68)均明顯升高(P<0.05)。與模型組比，電針“扶突”后cAMP mRNA、CREB mRNA表達(dá)量(0.13±0.02，0.39±0.01)顯著降低(P<0.05)，而電針“合谷-內(nèi)關(guān)穴”(0.47±0.06，2.97±0.57)以及“足三里-陽陵泉”(0.51±0.09，3.71±0.64)的效果不明顯(P>0.05)。電針“扶突穴”下調(diào)

15、cAMP、CREB基因表達(dá)的作用，明顯優(yōu)于電針“合谷-內(nèi)關(guān)穴”以及“足三里-陽陵泉”穴區(qū)(P<0.05)。與正常組(1.38±0.1)比較，模型組頸髓背角MAPK mRNA表達(dá)量(1.72±0.36)增多，但未達(dá)顯著差異(P>0.05)；針刺各組(1.68±0.17，1.77±0.4，1.91±0.33)基本沒明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。
　　術(shù)后，模型組CREB蛋白表達(dá)量(0.65±0.16)比正常組(0.6

16、4±0.03)增多，針刺扶突穴組CREB蛋白表達(dá)量(0.54±0.13)降低，但未達(dá)顯著差異(P>0.05)；針刺合谷-內(nèi)關(guān)組，足三里-陽陵泉組CREB蛋白表達(dá)量(0.43±0.04，0.33±0.03)明顯降低(P<0.05)。與正常對照組(0.31±0.02)比較，模型組p-CREB蛋白表達(dá)量(0.42±0.03)顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，電針扶突穴組，合谷-內(nèi)關(guān)組p-CREB蛋白表達(dá)量(0.31±0.05，0.29±

17、0.02)均明顯降低(P<0.05)，針刺足三里-陽陵泉組p-CREB蛋白的表達(dá)量(0.34±0.05)無明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1大鼠頸部切口創(chuàng)傷可引起的明顯的痛反應(yīng)，使大鼠痛閾降低，并可持續(xù)約5天；電針扶突、合谷-內(nèi)關(guān)穴可明顯抑制切口痛大鼠的疼痛反應(yīng)；
　　2電針扶突穴區(qū)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)時可明顯抑制切口痛引起的脊髓頸段背側(cè)區(qū)興奮性氨基酸受體mGluR5 mRNA及mGluR5蛋白的表達(dá)顯著升高，輕度