抑制T細(xì)胞誘導(dǎo)同種異體胰島移動(dòng)耐受.pdf

1、目的:我國已成為世界糖尿病第二大國,胰島移植是治療糖尿病最有前景的手段之一,而免疫排斥和供體短缺問題是胰島移植面臨的主要難題,免疫排斥問題使胰島生存期不理想進(jìn)而需要多次胰島移植,進(jìn)一步加劇了供體短缺的問題。胰島移植術(shù)后大量昂貴的的免疫抑制劑也給患者帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。本課題以抑制T細(xì)胞誘導(dǎo)胰島移植耐受為中心,從兩個(gè)方面開展研究,一方面開發(fā)免疫抑制效果更好、副作用更小、成本更低的免疫抑制劑,另一方面研究記憶性T細(xì)胞(Memory T cel

2、ls,Tm)在胰島移植中的作用機(jī)制和抑制方法。
　　 方法:一方面我們嘗試探索As2O3對于胰島移植免疫排斥反應(yīng)的抑制作用:首先通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)研究As2O3對于T細(xì)胞的抑制作用和機(jī)制,以及對胰島細(xì)胞的毒性;其次,建立小鼠同種異體胰島移植模型,研究As2O3或在聯(lián)合使用。Rapa的情況下對于胰島生存期的影響;最后,通過對T淋巴細(xì)胞亞群、Th1/Th2相關(guān)炎癥因子、移植物病理切片等進(jìn)行研究,試圖闡明As2O

3、3抑制T細(xì)胞誘導(dǎo)胰島移植耐受的機(jī)制以及作為免疫抑制藥物的可行性。另一方面,系統(tǒng)研究了糖尿病患者體內(nèi)存在的同種反應(yīng)性Tm細(xì)胞和胰島組織特異性的Tm細(xì)胞對胰島移植物的影響及解決方法:首先為了研究同種反應(yīng)性Tm細(xì)胞介導(dǎo)的加速排斥的作用及機(jī)制,我們通過對受體同品系小鼠進(jìn)行同種異體皮膚移植,使其經(jīng)受預(yù)致敏并產(chǎn)生大量同種反應(yīng)性Tm細(xì)胞:其次,通過提取這些CD4+和CD8+同種反應(yīng)性Tm細(xì)胞并過繼轉(zhuǎn)移給naive的受體小鼠,建立加速性排斥模型,通過生

4、存期的變化研究這些Tm細(xì)胞對胰島移植物生存期的影響,并嘗試使用單克隆抗體特異的阻斷CD134和CD122信號通路來特異的抑制這些Tm細(xì)胞的作用,延長移植物的生存期;再次,在序貫胰島移植模型中,通過生存期的變化來驗(yàn)證阻斷CD134和CD122信號通路分別抑制CD4+ Tm細(xì)胞和CD8+ Tm細(xì)胞對于其胰島移植物生存期的影響,并通過對T淋巴細(xì)胞亞群、Th1/Th2相關(guān)炎癥因子、移植物病理切片等實(shí)驗(yàn)手段,試圖闡明生存期變化的機(jī)制;最后,以NO

5、D小鼠為模型,研究發(fā)生嚴(yán)重糖尿病NOD小鼠中Tm細(xì)胞比例的的變化,并通過將這些Tm細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給NOD-scid小鼠,觀察NOD-scid的發(fā)病情況,以驗(yàn)證NOD小鼠體內(nèi)Tm細(xì)胞是否為胰島組織特異性Tm細(xì)胞,之后嘗試通過使用單克隆抗體阻斷CD134L和CD122信號通路,抑制胰島組織特異性Tm細(xì)胞,保護(hù)胰島免受Tm細(xì)胞介導(dǎo)的破壞作用。
　　 結(jié)果:在關(guān)于As2O3作為胰島移植免疫抑制劑的可能性以及作用機(jī)制的研究中,我們有以下結(jié)果

6、:首先,體外實(shí)驗(yàn)中,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)2～4μMAs2O3可以顯著抑制T細(xì)胞的增殖,并且具有劑量依賴性,并且在淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)體系中加入外源IL-2不能逆轉(zhuǎn)As2O3對T細(xì)胞增殖的抑制作用,說明As2O3的作用機(jī)制并不是誘導(dǎo)T細(xì)胞無能;其次,T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明As2O3可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡,2μMAs2O3誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡率達(dá)到80％,4μM As2O3誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡率達(dá)95％,凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果相同,均是在2-4gM

7、As203即具有非常好的效果,說明誘導(dǎo)凋亡才是.As2O3抑制T細(xì)胞增殖的主要機(jī)制;再次,體內(nèi)試驗(yàn)中,As2O3聯(lián)合半劑量Rapa可以抑制免疫排斥反應(yīng),顯著延長胰島移植物的生存期,達(dá)到甚至超過全劑量Rapa的效果(有1/5的受體鼠移植生存期＞100天達(dá)到耐受);最后,我們通過對受體移植物、血清以及脾臟中T細(xì)胞亞群的檢測發(fā)現(xiàn),As2O3聯(lián)合半劑量Rapa可以顯著降低受體鼠CD4+、CD8+ T細(xì)胞的比例以及血清中Th1/Th2因子的濃度,

8、同時(shí)移植物中炎細(xì)胞浸潤數(shù)量也相應(yīng)減少,這些結(jié)果表明,As2O3與半劑量的Rapa聯(lián)合,在降低Rapa用量的同時(shí),可以對供體反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)行克隆清除,減少炎細(xì)胞向移植物浸潤,從而抑制了T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng),保護(hù)了抑制物,延長了移植物的生存期。在關(guān)于Tm細(xì)胞在胰島移植中的作用及機(jī)制的研究中,我們主要由以下發(fā)現(xiàn):首先,同種反應(yīng)性Tm細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移胰島移植模型中,受體鼠均可以加速排斥胰島移植物,說明同種反應(yīng)性的Tm細(xì)胞對胰島移植物確實(shí)是很大的威脅

9、;其次,用藥干預(yù)結(jié)果表明,阻斷CD134L和CD122信號通路可以分別很好的抑制CD4+。Tm細(xì)胞和CD8+ Tm細(xì)胞,誘導(dǎo)CD4+ Tm細(xì)胞或CD8+ Tm細(xì)胞胰島移植物的耐受;再次,我們進(jìn)一步在序貫?zāi)Ｐ椭序?yàn)證了此結(jié)果,發(fā)現(xiàn)序貫?zāi)Ｐ蛯σ葝u移植物的排斥反應(yīng)更為強(qiáng)烈,無藥物處理組生存期更短,通過使用單克隆抗體阻斷CD134L和CD122信號通路后可以延長胰島移植物的生存期;通過對受體脾臟淋巴細(xì)胞亞群、血清、移植物的檢測發(fā)現(xiàn),聯(lián)合使用抗體后

10、,受體鼠外周CD4+ Tm細(xì)胞、CD8+ Tm細(xì)胞的比例明顯降低,Tregs比例明顯升高,血清Th1型細(xì)胞因子濃度下降,耐受誘導(dǎo)因子濃度升高,移植物中炎細(xì)胞浸潤程度降低,炎癥因子表達(dá)量也降低,表明聯(lián)合用藥通過克隆清除、克隆無能、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的機(jī)制抑制了Tm細(xì)胞,具有誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受的可能;最后,我們對胰島組織特異性Tin細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)生糖尿病的NOD小鼠體內(nèi)的Tm細(xì)胞顯著升高,將這些Tm細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至NO

11、D-scid小鼠中,可以誘導(dǎo)其發(fā)生糖尿病,表明1型糖尿病患者體內(nèi)的Tm細(xì)胞確實(shí)是胰島組織特異性Tm細(xì)胞,對胰島組織是很大的威脅。而阻斷CD134L和CD122信號通路可以分別很好的抑制胰島組織特異性CD4+ Tm細(xì)胞和CD8+ Tm T細(xì)胞。
　　 結(jié)論:通過本研究,一方面我們首次證實(shí)傳統(tǒng)中藥As2O3在胰島移植模型中可以通過誘導(dǎo)凋亡對供體反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)行克隆清除,從而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的發(fā)生,同時(shí)對胰島破壞作用較小,有可

12、能成為臨床胰島移植的免疫抑制劑;另一方面,針對胰島移植可能面臨Tm細(xì)胞介導(dǎo)的加速性排斥的問題,我們首次從同種異體反應(yīng)性Tm細(xì)胞和組織特異性Tm細(xì)胞兩個(gè)切入點(diǎn)入手,證實(shí)了Tm細(xì)胞確實(shí)可以介導(dǎo)胰島移植物的加速性排斥,是胰島中應(yīng)當(dāng)予以重視的問題,而阻斷CD134L和CD122信號通路可以分別有效的抑制CD4+ Tm細(xì)胞和CD8+ Tm細(xì)胞的作用,通過包含克隆清除、克隆無能和誘導(dǎo)Treg等作用機(jī)制誘導(dǎo)胰島移植物的長期存活。本研究的兩個(gè)成果對于臨