HBsAg負(fù)載DC細(xì)胞治療慢性乙型肝炎前后血清Th1-Th2水平的研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(Hepatitis B vires HBV)是很小的包膜病毒，HBV-DNA和HBV特異P蛋白由核殼包裹成為核心顆粒，再由含HBsAg的脂蛋白外膜包裹成完整的病毒顆粒。病毒基因組是3.2kb的部分雙鏈DNA，為嗜肝病毒，它的感染可造成乙型肝炎的發(fā)生。進(jìn)一步可發(fā)生肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。 采取臨床慢性乙型肝炎患者外周血，分離樹(shù)突細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后以表面抗原負(fù)載制備成特異的DC疫苗

2、，行自體回輸。觀(guān)察患者肝功能、HBV-DNA等指標(biāo)的變化，同時(shí)以酶聯(lián)免疫技術(shù)分別檢測(cè)DC疫苗治療前后患者體內(nèi)Th1/Th2水平的變化，Th1選取INF-γ代表，Th2選取IL-4為代表，判定DC疫苗治療慢性乙型肝炎的療效。測(cè)定DC疫苗治療后患者體內(nèi)ICAM-1及ICAM-3的水平，比較療效存在差異者上述兩因子的血清水平，判定其是否為DC疫苗治療效應(yīng)的影響因子。為臨床乙型肝炎的免疫治療提供理論依據(jù)。 方法：選取2004年5月-20

3、07年5月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院肝病中心門(mén)診或住院慢性乙型肝炎患者37例，其中男性30例，女性7例，年齡18歲-63歲，平均(37)歲。入選患者無(wú)其它肝炎病毒合并感染及嚴(yán)重并發(fā)癥，DC治療前半年內(nèi)未進(jìn)行過(guò)干擾素或核苷類(lèi)似物的藥物治療，全部獲得了知情同意。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》及2005《慢性乙型肝炎防治指南》。采用自身前后對(duì)照試驗(yàn)，在無(wú)菌條件下抽取受試者外周靜脈血20ml，肝素抗凝，在百級(jí)試驗(yàn)室進(jìn)行下面操作：生

4、理鹽水1:1稀釋抗凝血，層加到淋巴細(xì)胞分離液2000r/min離心30min，分離出外周血單核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用1640液洗2次，再加入含有體積分?jǐn)?shù)150ml/L人AB血清的1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×109/L的細(xì)胞濃度加入一次性6孔培養(yǎng)板中，于37℃50ml/LCO2飽和濕度下培養(yǎng)4h，棄上清液，再用1640培養(yǎng)液輕洗2次，除去非貼壁細(xì)胞，加入含8335μkat/LrhGM-CSF和8335μkat/LrhIL-4的完全培養(yǎng)基，隔

5、日換液，培養(yǎng)至第6天再加入終濃度為2.5mg/L的HBsAg，4h后加入終濃度為10μg/L的TNF，繼續(xù)在37℃50ml/LCO2飽和濕度下培養(yǎng)1d，收獲DC用生理鹽水洗滌2次并計(jì)數(shù)，即刻在受試者腋下部位常規(guī)消毒后經(jīng)皮下注入體內(nèi)。同時(shí)取細(xì)胞沈液做無(wú)菌實(shí)驗(yàn)。回輸2次為一個(gè)療程(間隔2wk)，每位患者均治療2個(gè)療程。分別檢測(cè)治療前及治療結(jié)束1月后的肝功能、HBV-DNA。留取患者治療前及治療1月后的血清，凍存于-80℃冰箱，集中檢測(cè)IL-

6、4、IFN-γ。同時(shí)檢測(cè)治療后患者血清的ICAM-1、ICAM-3，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)的檢測(cè)步驟進(jìn)行。在回輸治療前后檢測(cè)指標(biāo)一致的基礎(chǔ)上，對(duì)DC疫苗治療慢性乙型肝炎做自身比較。結(jié)果： 1.治療前后患者生化學(xué)指標(biāo)：ALT、AST在治療后明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.001(表1)。 2.治療前后患者病毒學(xué)指標(biāo)：DC治療前后HBV-DNA下降大于2.01og10的19例，有效率：51.4％。(表2) 3 治療前后患者血

7、清Th1/Th2血清表達(dá)水平(表3)：DC治療后IFN-γ明顯升高，t=3.51，P＜0.0001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-4治療后明顯下降，t=2.12，P=0.03，＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4 治療后患者療效及血清ICAM-1、ICAM-3水平(表4、5)：DC治療后有效者19例，無(wú)效者18例，有效與無(wú)效兩組間ICAM-1、ICAM-3比較，ICAM-1方差齊性檢驗(yàn)：P=0.1372，＞0.1，t檢驗(yàn)：t=0.33，DF=3

8、 1，P=0.7421，＞0.05。ICAM-3方差齊性檢驗(yàn)：P=0.1223，＞0.1，t檢驗(yàn)：t=1.49，DF=31，P=0.1475，＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 乙型肝炎患者慢性化的主要原因是細(xì)胞免疫功能降低，不能有效清除機(jī)體內(nèi)的乙型肝炎病毒，分離患者自身外周血中的DC，行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后以HBsAg負(fù)載制備成特異性DC疫苗行自體回輸，可有效提高患者APC的提呈功能，有效改善Th1/Th2的失衡，促進(jìn)Th