胚胎干細(xì)胞來(lái)源的胰島樣細(xì)胞團(tuán)的移植排斥反應(yīng)及白藜蘆醇抗移植排斥作用的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、[目的]
　　 觀察移植小鼠對(duì)胚胎干細(xì)胞來(lái)源的胰島樣細(xì)胞團(tuán)的移植排斥反應(yīng)，探討中藥成分白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對(duì)胰島樣細(xì)胞團(tuán)的移植排斥作用，以了解胚胎干細(xì)胞來(lái)源的組織、細(xì)胞的免疫原性以及機(jī)體對(duì)他們的移植排斥情況，探討白藜蘆醇是否具有抗移植排斥作用、是否適合作為胰島移植的抗排異藥物，以求找到一種高效低毒、適合作為抗器官移植、特別是胰島移植排斥的新藥，為胰島移植的臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]

2、>　　 1.小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)的擴(kuò)增及向胰島素分泌細(xì)胞定向分化的體外誘導(dǎo)：
　　 1.1 ESC的擴(kuò)增：將ESC接種于經(jīng)絲裂霉素處理后的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonic fibroblast，MEF)飼養(yǎng)層上，在含白血病抑制因子(LIF)的ESC培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4天后，按1:4比例傳代擴(kuò)增一次。。
　　 1.2擬胚體(embryoid bodies，EBs)

3、的形成：將培養(yǎng)3-4天的ESC消化后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿，在EBs培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4-5天，使ESC自發(fā)分化為EBs。
　　 1.3 nestin陽(yáng)性細(xì)胞(nestin positive cells，NPCs)的形成：將培養(yǎng)4-5天的EB轉(zhuǎn)種于Ⅰ型膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，貼壁后更換為NPCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3天可形成NPCs。
　　 1.4胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells，IPCs)

4、的形成：NPC形成后，更換為IPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基，至第4d，培養(yǎng)液中添加濃度為10mmol/L的葡萄糖，24h后更換為含葡萄糖20mmol/L的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至IPC聚集為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(islet-like cell clusters，ICCs)。并用雙硫腙(DTZ)染色進(jìn)行鑒定。
　　 2.移植動(dòng)物準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)選取6～8周齡昆明小鼠作為移植受體。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為四個(gè)小組，每組3只。①CsA陽(yáng)性對(duì)照組：按5mg/kg體重的劑量給予環(huán)孢

5、霉素-A(CsA)0.5mL，腹腔注射；②Res實(shí)驗(yàn)組：按60mg/Kg體重的劑量給予白藜蘆醇(Res)0.5mL，腹腔注射；③CsA+Res實(shí)驗(yàn)組：分別按5mg/kg體重的劑量給予環(huán)孢霉素-A(CsA)0.25mL和60mg/Kg體重的劑量給予白藜蘆醇(Res)0.25mL，腹腔注射；④陰性對(duì)照組：不給任何藥物處理，僅腹腔注射0.5mL磷酸鹽緩沖液(PBS)。以上四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于移植前3天開(kāi)始每天腹腔注射一次，直至取材日終止給藥。

6、r>　　 3.ICCs移植及移植排斥反應(yīng)情況的檢測(cè)：將待移植的ICCs用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記，以便了解移植后的ICCs在小鼠體內(nèi)的存活增殖情況。按平均每只小鼠200個(gè)細(xì)胞團(tuán)的量，經(jīng)注射移植到小鼠頸背部皮下脂肪組織，做好標(biāo)記。移植后4天、8天及16天分批取移植有ICCs的脂肪組織，將每組標(biāo)本一部分制作成冰凍切片，利用DAPI標(biāo)記，采用激光共聚焦顯微鏡觀察移植細(xì)胞的存活增殖情況；另一部分制作成普通病理切片后常規(guī)H

7、E染色，觀察宿主對(duì)移植的ICCs的免疫排斥情況；另一部分切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察免疫排斥情況及Th1(IL-2、IFN-γ)和Th2(IL-6、IL-10)類細(xì)胞因子的表達(dá)情況，以了解Res的抗移植排斥效果，分析抗移植排斥的機(jī)理。
　　 [結(jié)果]
　　 1.ESC接種于飼養(yǎng)層MEF，經(jīng)過(guò)3-4天的增值，ESC在有LIF存在時(shí)可形成致密的圓形或橢圓形集落。每4天傳代一次。
　　 2.在去除分化抑制因素后，ES

8、C在懸浮狀態(tài)培養(yǎng)4-5天后可自發(fā)形成球形細(xì)胞團(tuán)，即擬胚體EBs。EBs在NPCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)3-4天，可形成上皮細(xì)胞樣的nestin染色陽(yáng)性細(xì)胞(NPCs)。NPC在IPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基中做定向誘導(dǎo)培養(yǎng)6天后可形成為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)。細(xì)胞團(tuán)DTZ染色呈陽(yáng)性，被染為深棕紅色，說(shuō)明細(xì)胞團(tuán)中有胰島素分泌細(xì)胞(IPCs)。
　　 3.移植前將待移植的胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)用DAPI標(biāo)記后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，可見(jiàn)一團(tuán)團(tuán)與

9、ICCs形態(tài)一致的藍(lán)色熒光，說(shuō)明ICCs標(biāo)記成功；移植后8天取材的標(biāo)本制成冰凍切片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察仍可見(jiàn)成團(tuán)的藍(lán)色熒光散在分布于脂肪團(tuán)中，可判斷為經(jīng)DAPI標(biāo)記后的ICCs所發(fā)出的藍(lán)色熒光。
　　 4.HE染色及免疫組織化學(xué)方法半定量分析結(jié)果比較顯示：各組均有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)，說(shuō)明胚胎干細(xì)胞來(lái)源的ICCs移植后存在明顯的免疫排斥反應(yīng)。藥物處理組(CsA、Res、CsA+Res)炎癥細(xì)胞浸

10、潤(rùn)程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的脂肪組織中可見(jiàn)許多呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng)的、類似胰島素分泌細(xì)胞(IPCs)的小圓形細(xì)胞。細(xì)胞團(tuán)塊內(nèi)似有新生血管生成。非藥物處理組(對(duì)照組)只見(jiàn)許多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)似胰島素分泌細(xì)胞(IPCs)的小圓形細(xì)胞。冰凍切片上夜未見(jiàn)DAPI標(biāo)記細(xì)胞發(fā)出的藍(lán)色熒光。說(shuō)明移植細(xì)胞已經(jīng)完全被排斥消失。細(xì)胞因子免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CsA組的IL-2、IFN-γ、IL-6及IL-10的陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.50％、74.5

11、0％、56.50％及11.50％，Res組分別為18.50％、31.50％、28.50％及21.50％，CsA+Res組分別為15.50％、23.50％、26.50％及45.00％。CsA組的IL-2、IFN-γ及IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Res組和CsA+Res組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CsA+Res組的IL-10的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于CsA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Res組與CsA組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

12、=0.08)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用分階段誘導(dǎo)方法，胚胎干細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)，可以在18天的時(shí)間內(nèi)獲得具有胰島素分泌功能的胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)。
　　 2.通過(guò)移植前后在激光共聚焦顯微鏡都可以觀察到經(jīng)DAPI標(biāo)記的細(xì)胞團(tuán)所發(fā)出的藍(lán)色熒光，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組移植8天后仍有IPC存活。
　　 3.白藜蘆醇相比與環(huán)孢霉素-A更能降低IL-2、IFN-γ及IL-6的表達(dá)。白藜蘆醇與環(huán)孢霉素-A聯(lián)