聚季銨鹽-1作為眼用制劑抑菌劑的應(yīng)用研究.pdf

1、眼睛是人類(lèi)的重要感覺(jué)器官，但隨著人們生活習(xí)慣與環(huán)境的變化以及無(wú)紙化辦公的普及，視疲勞、角膜結(jié)膜炎、干眼癥等眼病患者的數(shù)量逐年增加。眼用制劑直接用于眼部治療眼科疾病，其用藥安全性一直為人們所關(guān)心。目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)多劑量包裝的眼用制劑中均含有抑菌劑（也稱(chēng)防腐劑），以避免微生物污染、保證藥品質(zhì)量。
　　 近年來(lái)，有關(guān)眼用制劑抑菌劑眼部刺激性、對(duì)角膜的毒性等不良反應(yīng)的報(bào)道日益增加。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用含有抑菌劑的眼用制劑患者，如白內(nèi)障、青

2、光眼和干眼癥等患者，會(huì)影響其淚膜穩(wěn)定性，造成角、結(jié)膜等眼組織損傷，嚴(yán)重者甚至失明。因此，尋找溫和型抑菌劑或抑菌系統(tǒng)是當(dāng)今眼用制劑研發(fā)的重點(diǎn)。
　　 聚季銨鹽-1（Polyquatemium-1，以下簡(jiǎn)稱(chēng)PQ-1）具有抑菌作用強(qiáng)、眼部刺激性小的特點(diǎn)，已作為殺菌劑在隱形眼鏡護(hù)理液中得到廣泛應(yīng)用，但在滴眼液等藥品中的研究和應(yīng)用較少。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)廠家生產(chǎn)PQ-1，也沒(méi)有PQ-1的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題旨在開(kāi)發(fā)PQ-1在眼用制劑中的應(yīng)用，對(duì)

3、其合成工藝及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)行探索;建立了差示分光光度法測(cè)定PQ-1的含量;通過(guò)營(yíng)養(yǎng)肉湯試管二倍稀釋法測(cè)定PQ-1的最小抑菌濃度（Minimuminhibitoryconcentration，以下簡(jiǎn)稱(chēng)MIC）和最小殺菌濃度（Minimumbactericidalconcentration，以下簡(jiǎn)稱(chēng)MBC），考察其抑菌穩(wěn)定性并對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行初步探究;研究PQ-1對(duì)人角膜上皮細(xì)胞（Humancornealepithelialcell，以下簡(jiǎn)稱(chēng)HC

4、EpiC）的毒性作用;以PQ-1作為滴眼液的抑菌劑，通過(guò)抑菌效力測(cè)試，篩選PQ-1在滴眼液中的有效濃度。
　　 1、聚季銨鹽-1的合成、結(jié)構(gòu)表征及分子量測(cè)定
　　 目的:初步確定眼用輔料PQ-1的合成工藝。
　　 方法:以N,N，N，N-四甲基-2-丁烯-1，4-二胺(DA)、反（順）式-1，4-二氯-2-丁烯(DCB)和三乙醇胺(TEA)為原料，通過(guò)共聚合反應(yīng)制備PQ-1樣品;運(yùn)用核磁共振儀(NMR)和傅里葉變

5、換紅外光譜儀(FT-IR)對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;采用凝膠滲透色譜法(GPC法)測(cè)定產(chǎn)物的重均分子量(Mw)及Mw分布。
　　 結(jié)果:產(chǎn)物NMR圖譜中各基團(tuán)上的C和H的化學(xué)位移與PQ-1均一致，產(chǎn)物IR圖譜與PQ-1對(duì)照品IR圖譜也一致;產(chǎn)物Mw為19432，Mw/Mn小于3.0。
　　 結(jié)論:所選合成工藝簡(jiǎn)單可行，制備的PQ-1樣品Mw及Mw分布符合眼用級(jí)PQ-1的要求。
　　 2、差示分光光度法測(cè)定眼用制劑中聚季

6、銨鹽-1的含量
　　 目的:建立簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確測(cè)定眼用制劑中抑菌劑PQ-1含量的方法。
　　 方法:應(yīng)用PQ-1和臺(tái)盼藍(lán)之間反應(yīng)發(fā)生紅移現(xiàn)象，采用差示分光光度法，以臺(tái)盼藍(lán)溶液作為參比液，在波長(zhǎng)681nm處，測(cè)得臺(tái)盼蘭在不同濃度PQ-1溶液中的差示吸光度值（△A）。
　　 結(jié)果:PQ-1濃度在5.00～15.00μg·mL-1范圍內(nèi)，△A與溶液濃度呈良好線性關(guān)系(r=0.9996)，平均回收率（n=9）為97.8

7、％，RSD=0.87％。
　　 結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于測(cè)定常規(guī)眼用制劑中PQ-1的含量。
　　 3、聚季銨鹽-1抑菌作用的研究
　　 目的:研究PQ-1的抑菌活性及其穩(wěn)定性，并初步探究其抑菌作用機(jī)理。
　　 方法:采用營(yíng)養(yǎng)肉湯試管二倍稀釋法測(cè)定PQ-1對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的MIC和MBC，考察紫外光照射、溫度、pH和鹽濃度對(duì)PQ-1穩(wěn)定

8、性的影響。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，采用電導(dǎo)率法和透射電鏡觀察方法，考察了PQ-1對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響，并對(duì)其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室觀察，同時(shí)研究了PQ-1對(duì)該兩種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響。
　　 結(jié)果:PQ-1對(duì)5種實(shí)驗(yàn)菌的MIC和MBC分別為:大腸桿菌MIC16μg·mL-1、MBC16μg·mL-1，金黃色葡萄球菌MIC4μg·mL-1、MBC8μg·mL-1，銅綠假單胞菌MIC16μg·mL-1、MBC32μg·

9、mL-1，白色念珠菌MIC8μg·mL-1、MBC8μg·mL-1，黑曲霉MIC64μg·mL-1、MBC128μg·mL-1;PQ-1的抑菌活性不受紫外光和pH的影響，但會(huì)隨溫度和鹽濃度的升高而降低。菌液電導(dǎo)率值隨著PQ-1作用時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加;PQ-1作用后的菌體，表面粗糙并出現(xiàn)許多顆粒狀物，細(xì)胞壁有明顯褶皺和破裂。MIC的PQ-1顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，未出現(xiàn)大量生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。
　　 結(jié)論:PQ-1在較低濃度具有抑制微生物生長(zhǎng)

10、的活性，其對(duì)紫外照射和pH較穩(wěn)定，但高溫處理或在高滲環(huán)境下，其抑菌活性會(huì)顯著降低。PQ-1可能通過(guò)增加菌體細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)胞內(nèi)K+等電解質(zhì)的滲出，逐漸破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抑菌作用。
　　 4、聚季銨鹽-1對(duì)體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞毒性作用的研究
　　 目的:考察PQ-1對(duì)體外培養(yǎng)的HCEpiC的毒性作用。
　　 方法:建立HCEpiC的體外培養(yǎng)模型，將不同濃度的PQ-1(0.01％，0.005％，0.001％，

11、0.0005％)分別與細(xì)胞共同孵育，并于作用后10min、25min、1h、2h，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并采用四唑氮藍(lán)(MTT)分析法和細(xì)胞活性/毒性染色法評(píng)估PQ-1的細(xì)胞毒性。同時(shí)選取常用濃度的苯扎溴銨(0.01％)和羥苯乙酯(0.03％)進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，0.01％PQ-1、0.005％PQ-1和0.01％苯扎溴銨作用后的細(xì)胞連接逐漸松散，胞內(nèi)物質(zhì)逐漸泄漏，細(xì)胞變圓

12、并逐漸裂解;0.03％羥苯乙酯對(duì)HCEpiC作用1h內(nèi)細(xì)胞形態(tài)正常，但作用2h后部分細(xì)胞開(kāi)始腫脹變圓，并逐漸脫落;0.001％PQ-1和0.0005％PQ-1處理組的細(xì)胞形態(tài)完整，與正常組相比無(wú)肉眼可辨的顯著性差異;(2)MTT分析:隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，0.01％PQ-1、0.005％PQ-1、0.01％苯扎溴銨和0.03％羥苯乙酯處理組的HCEpiC存活率均降低，與正常組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);0.001％PQ-1和0.000

13、5％PQ-1處理組不同作用時(shí)間的HCEpiC存活率，與正常組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(3)細(xì)胞活性/毒性檢測(cè):0.01％PQ-1和0.005％PQ-1對(duì)HCEpiC作用10min后，仍可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞存活，但作用25min、1h、2h后，細(xì)胞幾乎全部死亡;0.001％PQ-1和0.0005％PQ-1對(duì)HCEpiC作用2h內(nèi)的細(xì)胞活性較好，活細(xì)胞數(shù)量一直維持在較高水平;0.01％苯扎溴銨處理組各作用時(shí)間的細(xì)胞活性均較低，幾乎無(wú)活細(xì)

14、胞存在;0.03％羥苯乙酯對(duì)HCEpiC作用1h內(nèi)的細(xì)胞活性較好，但作用2h后，死細(xì)胞數(shù)量明顯增加。
　　 結(jié)論:高濃度PQ-1對(duì)HCEpiC有一定的毒性作用，但常用濃度的三種抑菌劑之間比較，PQ-1的細(xì)胞毒性作用最小。
　　 5、聚季銨鹽-1用于滴眼液防腐的可行性研究
　　 目的:考察PQ-1與常用眼用輔料的配伍穩(wěn)定性，并對(duì)PQ-1用于眼用制劑防腐的可行性進(jìn)行研究和探討。
　　 方法:(1)通過(guò)配伍液的

15、澄清度檢查和透光率測(cè)定，分別考察了PQ-1與磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、玻璃酸鈉(SH)、依地酸二鈉（EDTA-2Na）、羥丙甲纖維素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮-K30（PVP-K30）、羥苯乙酯以及Tween80的配伍穩(wěn)定性;(2)考察了PQ-1與SH配伍時(shí)，SH的Mw和濃度、PQ-1濃度以及配伍液pH值對(duì)PQ-1與SH配伍液澄清度的影響;(3)選用規(guī)定范圍內(nèi)相對(duì)較低Mw的SH，同時(shí)加入增溶劑Tween80，將0.0001％PQ-1

16、和0.0001％PHMB聯(lián)用作為復(fù)合抑菌劑應(yīng)用于牛磺酸滴眼液中，并進(jìn)行了抑菌效力測(cè)試;(4)通過(guò)抑菌效力測(cè)試初步篩選了PQ-1在復(fù)方氯化鈉滴眼液中的使用濃度范圍。
　　 結(jié)果:(1)除SH外，PQ-1與其它常用眼用輔料均無(wú)配伍禁忌，與SH的配伍溶液有白色乳光產(chǎn)生;(2)PQ-1與SH的配伍溶液的澄清度與SH的Mw和濃度、PQ-1濃度均呈負(fù)相關(guān)，而受pH值(5～8)的影響較小;(3)選用0.0001％PQ-1和0.0001％PHM

17、B作為復(fù)合抑菌劑的?；撬岬窝垡阂志ЯΨ显u(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，且性狀合格;(4)復(fù)方氯化鈉滴眼液中PQ-1的最低使用濃度為0.0006％時(shí)，抑菌效力才能合格，初步確定了PQ-1的使用濃度范圍為0.0006％～0.0009％。
　　 結(jié)論:PQ-1與常規(guī)眼用輔料的配伍穩(wěn)定性較好，適用于常規(guī)眼用制劑的防腐，但本實(shí)驗(yàn)制備的以PQ-1作為抑菌劑的?；撬岬窝垡汉蛷?fù)方氯化鈉滴眼液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性以及如何實(shí)現(xiàn)PQ-1與SH在眼用制劑中的共存尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研