CacyBP-SIP核轉(zhuǎn)位在結(jié)腸癌中的意義.pdf

1、CacyBP是1998年發(fā)現(xiàn)的以鈣依賴的方式結(jié)合CalCyclin的蛋白；2001在研究P53刺激下β-catenin泛素化降解新通路時(shí)發(fā)現(xiàn)，SIP通過與泛肽連接酶結(jié)合，參與P53刺激下β-catenin的降解。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：SIP即CacyBP,因此目前命名為CacyBP/SIP。 CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白，S100家族是Ca2＋結(jié)合蛋白家族中最大的亞類，以組織特異性的方式作為鈣信號(hào)的傳導(dǎo)器，與特異的靶蛋

2、白相互作用，介導(dǎo)鈣信號(hào)對(duì)細(xì)胞的調(diào)控?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可與S100A1、A6、A12、B、P結(jié)合，它們均與腫瘤的進(jìn)展/轉(zhuǎn)移有關(guān)。近有研究表明CacyBP/SIP與細(xì)胞分化、發(fā)育有關(guān)。在研究小鼠受孕子宮發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，CacyBP/SIP的表達(dá)逐漸升高，第7天時(shí)達(dá)高峰，其表達(dá)受雌、孕激素的調(diào)節(jié)，表明它與受孕子宮內(nèi)膜細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)；心肌肥大時(shí)CacyBP/SIP表達(dá)上調(diào)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)它可促進(jìn)H9C2細(xì)胞及小鼠心肌的分化

3、及DNA合成。 已有兩家研究機(jī)構(gòu)報(bào)道，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CacyBP/SIP具有依賴于Ca2＋濃度的核轉(zhuǎn)位及磷酸化現(xiàn)象。Ca2＋是細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使，通過其濃度的變化來傳遞信息。在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，同時(shí)發(fā)生磷酸化；細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度降低時(shí)，CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿，同時(shí)發(fā)生去磷酸化。蛋白轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核且發(fā)生磷酸化對(duì)于傳遞細(xì)胞外信號(hào)，調(diào)控下游基因表達(dá)具有重要意義。但這種現(xiàn)象究竟有何意

4、義呢？本課題將對(duì)此進(jìn)行探討。 目的: 1、CacyBP/SIP單克隆抗體的制備；2、CacyBP/SIP在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)分布；3、CacyBP/SIP在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及功能；4、CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位影響結(jié)腸癌細(xì)胞功能的可能機(jī)制。 方法: 1、應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜瘤技術(shù)制備小鼠源性抗人CacyBP/SIP Mab，采用Western Blot及ELISA等方法鑒定抗體的特異性和敏感性；2、應(yīng)

5、用正辛酸-飽和硫酸銨方法純化抗體，通過SP免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察CacyBP/SIP在正常組織和腫瘤組織中的分布；3、利用免疫組化、Western Blot觀察CacyBP/SIP在結(jié)腸癌、癌旁組織、結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)和細(xì)胞定位；4、通過基因重組方法構(gòu)建CacyBP/SIP的siRNA載體、全長載體、C端截短體；5、間接免疫熒光細(xì)胞內(nèi)染色、Western Blot檢測(cè)CacyBP/SIP在胃泌素誘導(dǎo)下在結(jié)腸癌細(xì)胞中的定位；6、利用細(xì)胞M

6、TT實(shí)驗(yàn)、平皿克隆形成試驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)等研究CacyBP/SIP入核對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HT29增殖的影響；7、通過Western Blot、激酶實(shí)驗(yàn)、co-IP觀察CacyBP/SIP入核后細(xì)胞周期蛋白及活性的變化；8、應(yīng)用蛋白酶抑制劑通過抑制泛素-蛋白酶體通路探討細(xì)胞周期蛋白改變的機(jī)制；9、利用激光共聚焦觀察C端截短體在細(xì)胞內(nèi)定位；10、利用Western Blot、co-IP觀察CacyBP/SIP截短體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞周期蛋

7、白表達(dá)變化。 結(jié)果: 1、制備了CacyBP/SIP 單克隆抗體獲得3 株抗CacyBP/SIP 的單克隆抗體，其亞型均為IgG(κ)亞類，間接ELISA測(cè)定腹水效價(jià)達(dá)1 ×10-7，Western Blot及ELISA表明三株Mab具有較高的特異性與敏感性，均能識(shí)別組織及細(xì)胞內(nèi)天然及變性CacyBP/SIP蛋白。 2、CacyBP/SIP 在正常及腫瘤組織中的分布以獲得單抗為工具，較系統(tǒng)研究CacyBP/S

8、IP 在正常組織及腫瘤組織中的表達(dá)。通過IHC 染色發(fā)現(xiàn)：心臟、腦中CacyBP/SIP 呈強(qiáng)染色，主要表達(dá)于心肌細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；在胃、結(jié)腸、肝等弱表達(dá)或表達(dá)缺失。在大多數(shù)腺上皮起源的腫瘤中，CacyBP/SIP 均著色，包括胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌等，其中在胰腺癌中顯示出較強(qiáng)的著色，在鼻咽癌中著色最強(qiáng)。CacyBP/SIP 亦可在鱗狀上皮起源的腫瘤中著色，如肺鱗癌及食道鱗癌。我們還發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP 在其它細(xì)胞來源的腫瘤

9、中著色：如膀胱/輸尿管移行細(xì)胞癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，骨肉瘤。在肝癌、黑色素瘤及卵巢癌中著色罕見或缺失。CacyBP/SIP 在多數(shù)正常組織不表達(dá)或弱表達(dá)，而在多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)，這一結(jié)果提示CacyBP/SIP 可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展起作用。 3、CacyBP/SIP 在結(jié)腸癌中高表達(dá)我們利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了CacyBP/SIP 在10 例正常結(jié)腸粘膜，50 例結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP 主要定位于

10、結(jié)腸癌細(xì)胞的胞漿和胞核，在正常結(jié)腸粘膜表達(dá)缺失，結(jié)腸癌表達(dá)陽性率（51％），明顯高于癌旁組織（26％，p<0.05）。Western Blot 顯示CacyBP/SIP 在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁組織（p<0.05）。對(duì)3 種結(jié)腸癌細(xì)胞系中CacyBP/SIP 表達(dá)顯示，HT29 及SW480 細(xì)胞中均表達(dá)CacyBP/SIP。以上研究結(jié)果說明CacyBP/SIP 在結(jié)腸癌中高表達(dá)，可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。 4、

11、胃泌素可誘導(dǎo)CacyBP/SIP 轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核胃泌素作為內(nèi)分泌激素，除具有促進(jìn)胃酸分泌的功能，還是體內(nèi)重要的生長因子，研究已證實(shí)它可促進(jìn)正常結(jié)腸粘膜及結(jié)腸癌的增殖，與受體結(jié)合后可升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子；而CacyBP/SIP 具有依賴鈣離子濃度的核轉(zhuǎn)位。那么，胃泌素可否誘導(dǎo)CacyBP/SIP 核轉(zhuǎn)位呢？我們給予胃泌素刺激后，間接免疫熒光、Western Blot 顯示CacyBP/SIP 轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。我們進(jìn)而構(gòu)建了CacyBP/SIP的兩

12、個(gè)siRNA 載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了結(jié)腸癌SW480 和HT29 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIPsi1 載體能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中CacyBP/SIP 的表達(dá)，命名為SW480-CacyBP/SIPsi 及HT29-CacyBP/SIPsi，此細(xì)胞在胃泌素刺激后，間接免疫熒光、Western Blot 顯示CacyBP/SIP 無轉(zhuǎn)位現(xiàn)象發(fā)生。我們通過給予胃泌素誘導(dǎo)CacyBP/SIP 核轉(zhuǎn)位，建立了研究CacyBP/SIP 入核功能的細(xì)胞模

13、型；通過抑制CacyBP/SIP 的表達(dá)，建立了研究CacyBP/SIP 入核受抑的細(xì)胞模型。 5、CacyBP/SIP 入核可促進(jìn)結(jié)腸癌增殖我們采用MTT 法、平皿克隆形成試驗(yàn)探討胃泌素誘導(dǎo)CacyBP/SIP 核轉(zhuǎn)位后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未加胃泌素的對(duì)照細(xì)胞相比，給予胃泌素后促細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)(P<0.05)，促細(xì)胞集落形成明顯增加(P<0.05)；細(xì)胞周期結(jié)果表明：與未刺激組相比，給予胃泌素后，SW48

14、0 與HT29細(xì)胞的G1 期明顯縮短。在SW480-CacyBP/SIPsi 及HT29-CacyBP/SIPsi 中，CacyBP/SIP 入核受抑，MTT、平皿克隆形成試驗(yàn)表明：與未加胃泌素的對(duì)照細(xì)胞相比，給予胃泌素后細(xì)胞增殖的差別無顯著性差異(P>0.05)，促細(xì)胞集落形成的能力無明顯差異(P>0.05)。細(xì)胞周期結(jié)果表明：與未刺激組相比，給予胃泌素后，SW480-CacyBP/SIPsi 及HT29-CacyBP/SIPsi 細(xì)

15、胞的G1 期無明顯變化。以上研究提示CacyBP/SIP 核轉(zhuǎn)位可促進(jìn)結(jié)腸癌增殖，這種增殖作用可能通過促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展而實(shí)現(xiàn)的。 6、CacyBP/SIP通過增強(qiáng)泛素介導(dǎo)的P27kip1降解促結(jié)腸癌增殖為進(jìn)一步明確CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位后促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的分子機(jī)制，我們首先應(yīng)用Western Blot檢測(cè)G1期進(jìn)展中關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。應(yīng)用同步化藥物nocodazole處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480及HT29，結(jié)果表明：胃泌

16、素刺激后，P27kip1表達(dá)降低，Cyclin E蛋白表達(dá)升高。抑制CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位后P27kip1與Cyclin E的表達(dá)無變化。Cdk2激酶活性檢測(cè)明顯升高，同時(shí)細(xì)胞中P27kip1結(jié)合Cdk2的量減少。以此結(jié)果提示CaycBP/SIP入核后P27kip1蛋白量減少，Cdk2激酶活性增加，導(dǎo)致G1期進(jìn)展。給予蛋白酶體抑制劑MG132抑制26S蛋白酶體的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MG132處理細(xì)胞后，P27kip1、Cyclin E表

17、達(dá)無明顯變化，說明P27kip1降解的增強(qiáng)是通過26S蛋白酶通路。P27kip1是SCF泛素酶的靶蛋白，研究已發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP通過其C未端與Skp1結(jié)合，我們應(yīng)用CacyBP/SIP免疫共沉淀亦證實(shí)：在結(jié)腸癌細(xì)胞HT29及SW480中，CacyBP/SIP可以與Skp1結(jié)合。我們進(jìn)而構(gòu)建了CacyBP/SIP的截短體，CacyBP/SIP (Δ73–228)，缺失了C末端結(jié)構(gòu)域，并克隆入Pegfp/C1表達(dá)融合綠色熒光蛋白的質(zhì)粒

18、Pegfp/C1- CacyBP/SIP(Δ73–228)。轉(zhuǎn)染SW480-CacyBP/SIPsi細(xì)胞，激光共聚焦觀察C端截短體在胃泌素刺激后亦可入核。免疫共沉淀證實(shí)，該截短體不能與Skp1結(jié)合，與此同時(shí)，P27kip1的表達(dá)則無明顯變化。這一結(jié)果說明CacyBP/SIP通過與Skp1結(jié)合，增強(qiáng)了泛素-26S蛋白酶體復(fù)合物對(duì)P27kip1的降解。 結(jié)論: 本研究發(fā)現(xiàn)胃泌素誘導(dǎo)CacyBP/SIP入核后通過增強(qiáng)泛素介導(dǎo)