小麥phKL和節(jié)節(jié)麥Ppd-D1基因的遺傳評(píng)價(jià).pdf

1、目前應(yīng)用于普通小麥（Triticum aestivum L．，2n=6x=42，AABBDD）外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移中的Ph基因突變體ph1b，ph2a和ph2b都是通過(guò)人工誘變的方法獲得的，這些人工突變體在小麥外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移中已有許多研究。不同于上述人工突變體，四川小麥地方品種開(kāi)縣羅漢麥天然存在phKL基因，其誘導(dǎo)部分同源染色體配對(duì)能力類(lèi)似于Ph2基因突變體，該基因可能與Ph1和Ph2基因突變體有不同的遺傳作用機(jī)制，可能是一種新型的染色體

2、操作工具材料；光周期不敏感普通小麥在小麥栽培品種中占主導(dǎo)地位，對(duì)全世界小麥生產(chǎn)有重要貢獻(xiàn)。其中，2D染色體上的光周期基因Ppd-D1對(duì)小麥光周期不敏感，發(fā)揮了重要作用。在歐洲，多數(shù)對(duì)光周期不敏感的小麥光周期基因Ppd-D1來(lái)源于日本品種Akakomugi。由于僅有極少數(shù)的節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii Coss．，2n=2x=14，DD）參與了六倍體小麥的起源與進(jìn)化，節(jié)節(jié)麥2D染色體上可能存在一些目前普通小麥遺傳群體不具有的

3、光周期基因位點(diǎn)。 本文圍繞開(kāi)縣羅漢麥天然的phKL基因和節(jié)節(jié)麥的光周期基因Ppd-D1進(jìn)行相關(guān)研究。利用具有phKL的開(kāi)縣羅漢麥與外源物種Aegilops peregrina（2n=4x=28，UUSsSs）遠(yuǎn)緣雜交，選育穩(wěn)定株系，并對(duì)穩(wěn)定株系進(jìn)行分子細(xì)胞學(xué)鑒定，以評(píng)價(jià)phKL基因在遠(yuǎn)緣雜交轉(zhuǎn)移外源基因的實(shí)際應(yīng)用效果；對(duì)通過(guò)phKL基因?qū)階e． peregrina遺傳物質(zhì)的小麥品系進(jìn)行條銹病抗性鑒定分析，獲得新的抗病材料；研究

4、節(jié)節(jié)麥的光周期基因的遺傳多樣性，并轉(zhuǎn)入六倍體遺傳背景中，評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。主要研究結(jié)果如下： 1．用含有phKL基因的開(kāi)縣羅漢麥與Ae． peregrina居群13E遠(yuǎn)緣雜交，雜種用小麥品系3854回交2次后，連續(xù)自交選擇，獲得農(nóng)藝性狀穩(wěn)定、結(jié)實(shí)正常、染色體數(shù)2n=42的6個(gè)品系3121，3131，3141，3161，3171，3181。這6個(gè)品系在F3時(shí)來(lái)自同一個(gè)單株。其中，3161，3171，3181在F4時(shí)是同一個(gè)單株，在F

5、5后分別為3個(gè)農(nóng)藝性狀相似的姊妹系。這3個(gè)品系與普通小麥類(lèi)似，軟殼、易脫粒，方型穗，植株偏高。其中，3171在成株期抗條銹，而3161和3181感條銹。3121，3131，3141在F4時(shí)也是同一個(gè)單株，在F5后分別為3個(gè)單株的姊妹系。這三個(gè)姊妹系的穎殼硬且緊包種子，在室內(nèi)考種時(shí)不易脫粒，只能用手才能剝離，這種穎殼緊包種子而不易脫粒是Ae． Pperegrina的野生性狀。同時(shí)，這3個(gè)品系與Ae． peregrina居群13E相似之處還

6、表現(xiàn)在：穗型類(lèi)似，株型分散。從形態(tài)上看，3121：3131，3141可能轉(zhuǎn)入了2U或2SL染色體上的硬殼基因。這三個(gè)品系其余主要農(nóng)藝性狀也基本相似。3131和3141在田間無(wú)法區(qū)分，但是與3121能夠根據(jù)條銹病的抗性區(qū)分開(kāi)。3131和3141在成株期感條銹，而3121抗條銹。3121的抗條銹特征與13E類(lèi)似，而且其小麥親本不抗病，表明抗性來(lái)自13E。3121具有的抗病基因與13E的第2同源群硬殼位點(diǎn)無(wú)直接關(guān)系，可能受不同染色體（或片段）

7、控制。對(duì)抗條銹的新品系3121花粉母細(xì)胞觀察表明，染色體減數(shù)分裂過(guò)程正常，表明3121是個(gè)細(xì)胞學(xué)上穩(wěn)定的材料。它與開(kāi)縣羅漢麥雜種F1的絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞配成21個(gè)二價(jià)體。根據(jù)細(xì)胞學(xué)和農(nóng)藝性狀資料，3121可能是一個(gè)具有兩個(gè)以上易位的易位系。本研究表明，phKL基因在外源基因轉(zhuǎn)移方面有較大的應(yīng)用價(jià)值。但是，通過(guò)染色體C帶和基因組原位雜交，未成功檢測(cè)出易位染色體。下一步，需要用更靈敏的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)出上述品系的易位片段。 2．以

8、開(kāi)縣羅漢麥為母本，13E為父本雜交，將雜種F1中將自交結(jié)實(shí)的種子，分單株種植，而后選結(jié)實(shí)率較高單株自交至F9，選出3271，3281，3291，3301，3311等比較穩(wěn)定的品系。盡管這些品系的穗子比開(kāi)縣羅漢麥偏長(zhǎng)，小穗數(shù)增多，但是與親本比較，普遍存在結(jié)實(shí)率偏低問(wèn)題。細(xì)胞學(xué)觀察表明，這些品系為細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定的材料。這些品系結(jié)實(shí)率不高，可能不是由于細(xì)胞學(xué)上的減數(shù)分裂不正常引起的，而可能是由于導(dǎo)入外源染色體片段不能完全補(bǔ)償缺失的小麥染色體的遺傳

9、物質(zhì)，致使育性降低。進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)3271與KL的雜種F1染色體觀察，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞配成21個(gè)二價(jià)體，表明品系3271可能是易位系。對(duì)這些品系的高分子量谷蛋白亞基和微衛(wèi)星（SSR）分子標(biāo)記分析揭示了新的變異，表明在遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中產(chǎn)生了遺傳變異。 3．對(duì)56個(gè)不同來(lái)源節(jié)節(jié)麥的抽穗期遺傳評(píng)價(jià)表明，節(jié)節(jié)麥抽穗期存在很大差異。以抽穗期相差7天作為一個(gè)間隔，56個(gè)節(jié)節(jié)麥材料被劃分為4種類(lèi)型。類(lèi)型Ⅰ具有相對(duì)短的抽穗期（在169到17

10、6天之間）。類(lèi)型Ⅱ抽穗期在177到184天之間。類(lèi)型Ⅰ和類(lèi)型Ⅱ所包含的所有節(jié)節(jié)麥材料均屬于節(jié)節(jié)麥tauschii亞種。類(lèi)型Ⅲ抽穗期在185到192天之間。類(lèi)型Ⅳ抽穗期超過(guò)193天。抽穗期與其地理分布相關(guān)。分布于我國(guó)新疆伊犁河流域和黃河流域的所有節(jié)節(jié)麥都具有早的抽穗期（類(lèi)型Ⅰ），它們均屬于節(jié)節(jié)麥tauschii亞種。另一方面，所有strangulata亞種的節(jié)節(jié)麥只分布于外高加索（亞美尼亞和阿塞拜疆）和伊朗的里海，它們具有晚的抽穗期。三個(gè)

11、人工合成六倍體小麥SHW-L1，Syn-SAU-13和Syn-SAU-14的抽穗期分別為182天，189天和189天。它們的共同四倍體供體小麥圓錐麥AS2255的抽穗期為171天，而其三個(gè)不同節(jié)節(jié)麥ssp． tauschii AS60，ssp． tauschii AS2395和ssp． strangulata AS2393的抽穗期分別為173天，195天和195天。由于SHW-L1的抽穗期比Syn-SAU-13和Syn-SAU-14要早

12、7天，推測(cè)人工合成六倍體小麥的抽穗期早晚與供體節(jié)節(jié)麥的抽穗期早晚相關(guān)。進(jìn)一步的遺傳分析表明，人工合成六倍體小麥SHW-L1的2D染色體，在SHW-L1和中國(guó)春雜種F2的遺傳背景下，能縮短抽穗期5天以上。人工合成小麥SHW-L1的2D染色體是由節(jié)節(jié)麥AS60提供。因此推測(cè)，節(jié)節(jié)麥含有的光周期位點(diǎn)與中國(guó)春的ppd-D1位點(diǎn)有差異。由于進(jìn)化的瓶頸效應(yīng)，節(jié)節(jié)麥tauschii亞種具有的光周期位點(diǎn)，可能沒(méi)有滲入到六倍體小麥中。因此節(jié)節(jié)麥tausc

13、hii亞種AS60中的光周期位點(diǎn)可作為六倍體小麥光周期育種的新資源。 4．前人通過(guò)對(duì)光周期不敏感和敏感小麥的比較研究發(fā)現(xiàn)，光周期不敏感品種的Ppd-D1基因編碼區(qū)上游序列出現(xiàn)了2089bp缺失，此缺失可能切除了某些調(diào)節(jié)基因或改變了轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，引起Ppd-D1的異常表達(dá)，從而啟動(dòng)光周期途徑，并最終導(dǎo)致提前抽穗。為了檢測(cè)光周期不敏感小麥品種Ppd-D1編碼區(qū)上游存在的2089bp缺失是否也存在節(jié)節(jié)麥中，我們運(yùn)用位于此缺失序列之內(nèi)

14、的PCR擴(kuò)增引物對(duì)8份節(jié)節(jié)麥擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。序列比較發(fā)現(xiàn)：（1）所有的8份節(jié)節(jié)麥與光周期敏感普通小麥一樣，沒(méi)有發(fā)生2098bp缺失。節(jié)節(jié)麥未發(fā)現(xiàn)該2089bp片段缺失表明，該片段缺失可能是在普通小麥起源之后產(chǎn)生的。由于這8份節(jié)節(jié)麥的抽穗期存在很大差異，表明節(jié)節(jié)麥抽穗期存在的差異與這整個(gè)2098 bp缺失無(wú)直接關(guān)系；（2）節(jié)節(jié)麥的這段序列存在兩個(gè)不同位置的缺失/插入短序列，分別包含24個(gè)堿基（8個(gè)氨基酸）和15個(gè)堿基（5個(gè)氨基

15、酸）。24堿基缺失/插入和臨近序列具有MITE（miniature terminal inverted repeat element）轉(zhuǎn)座子特征，該MITE有14 bp不完全的倒位重復(fù)序列（CCCATTGGGTATA與GATACCCGATGGG），同時(shí)產(chǎn)生了“TA”TSD（target site duplication）重復(fù)位點(diǎn)，表明可能是一個(gè)MITE活動(dòng)的結(jié)果；（3）存在這兩個(gè)短序列的節(jié)節(jié)麥都屬于ssp． tauschii，而缺失這兩

16、個(gè)短序列的節(jié)節(jié)麥都屬于ssp． strangulata。同時(shí)，普通小麥也缺失這兩個(gè)短序列。因此，本研究證明節(jié)節(jié)麥strangulata亞種是原始普通小麥光周期基因的供體。這也為節(jié)節(jié)麥strangulata亞種是普通小麥D基因組的供體物種提供了新的證據(jù)。（4）根據(jù)抽穗期資料，這兩個(gè)缺失/插入短序列與節(jié)節(jié)麥的抽穗期早晚并無(wú)必然的關(guān)系。 5．前人研究表明，普通小麥光周期基因中，Ppd-D1與Ppd-B1，Ppd-A1相比較有一個(gè)很大的

17、不同，就是Ppd-D1在其第8外顯子中少了16bp的片段。為了研究該16bp片段缺失是否來(lái)自于節(jié)節(jié)麥，我們對(duì)11份節(jié)節(jié)麥材料Ppd-D1基因的第8外顯子部分序列克隆測(cè)序。序列比較結(jié)果表明，與普通小麥不一樣，所有的節(jié)節(jié)麥都沒(méi)有該16bp片段缺失，這表明該缺失也可能是在普通小麥起源之后產(chǎn)生的。 6．節(jié)節(jié)麥AS60與普通小麥中國(guó)春的光周期基因在控制小麥抽穗早晚方面存在差異，節(jié)節(jié)麥AS60具有Ppd-Dt1基因的表現(xiàn)型，而中國(guó)春具有pp

18、d-D1基因的表現(xiàn)型。但是，AS60并不存在光周期不敏感普通小麥Ppd-D1基因編碼區(qū)上游序列出現(xiàn)的2089bp缺失。同時(shí)，節(jié)節(jié)麥AS60的Ppd-Dt1基因編碼區(qū)3’端的1572bp序列與普通小麥中國(guó)春相應(yīng)序列相比，除了上述提到的中國(guó)春存在16bp片段缺失之外，僅存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，表明該段序列差異較小。只有將節(jié)節(jié)麥AS60的整個(gè)Ppd-Dt1基因序列測(cè)出來(lái)，并與普通小麥比較，才能揭示節(jié)節(jié)麥AS60與普通小麥中國(guó)春的光周期基因在控制小