干擾素誘導(dǎo)蛋白p204、IFI16分別對鼠血管平滑肌細(xì)胞及人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分干擾素誘導(dǎo)蛋白p204對鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的初步研究
　　目的：研究干擾素誘導(dǎo)蛋白p204對大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖的影響并探討其可能的機(jī)制。
　　方法：用貼壁法離體培養(yǎng)SD大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞（VSMCs），通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞免疫組化方法鑒定細(xì)胞，原代培養(yǎng)經(jīng)傳代后的第3-4代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于下游實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5組，即陰性對照組（N組）、干擾素α（IFN-α）誘導(dǎo)組（IFN組）

2、、20％胎牛血清+IFN-α誘導(dǎo)組（F+I組）、Ifi204小干擾RNA（siRNA）組（siRNA組）及非特異性siRNA組（C組）。IFN組加終濃度為2000u/ml IFN-α，siRNA組轉(zhuǎn)染Ifi204基因的小干擾RNA，F(xiàn)+I組用20%胎牛血清刺激12h后與IFN組同步加IFN-α，分別干預(yù)6h，細(xì)胞去除干預(yù)因素后繼續(xù)培養(yǎng)48h后觀察mRNA、蛋白及細(xì)胞增殖的變化。用MTT法測定細(xì)胞活力反映細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，

3、用RT-PCR、Real Time qRT-PCR法和Western blotting分別檢測mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：VSMCs呈梭形或長梭形貼壁生長，倒置相差顯微鏡下細(xì)胞立體感明顯，傳代后5-7天細(xì)胞呈“鋪路石”樣，經(jīng)α肌動蛋白抗體（αSMA）免疫組化染色，＞95%的細(xì)胞染色陽性。IFN-α可誘導(dǎo)鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，降低VSMCs細(xì)胞活力和細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換，伴p21 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)

4、，Ras蛋白表達(dá)減少，Raf、Erk磷酸化水平下降。轉(zhuǎn)染Ifi204 siRNA可抑制p204和p21表達(dá)，伴Ras蛋白表達(dá)增多，提高VSMCs細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換。
　　結(jié)論：p204表達(dá)可抑制鼠 VSMCs的增殖，該效應(yīng)可能與激活 p21表達(dá)及抑制Ras/Raf/Mek/Erk信號通路的激活有關(guān)。
　　第二部分干擾素誘導(dǎo)蛋白IFI16對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的初步研究
　　目的：觀察干擾素誘

5、導(dǎo)蛋白IFI16對堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)增殖的影響，探討IFI16在VECs增殖調(diào)控中的作用及可能機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組（Control組）、IFN-α誘導(dǎo)組（IFN組）和siRNA組（siRNA組），各組均用bFGF（終濃度為100ug/L）刺激24h后IFN組加干擾素-α（IFN-α）、siRNA組轉(zhuǎn)染IFI16基因（Ifi16）的小干擾RNA（siRNA），分別干預(yù)6h

6、，然后觀察24h、48h、72h三個(gè)不同時(shí)間段的mRNA、蛋白及細(xì)胞增殖的變化。用MTT法測定細(xì)胞活力反映細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，用半定量RT-PCR法和Western blotting分別檢測IFI16和p21的mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)觀察Ras蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：IFN-α可誘導(dǎo)VECs IFI16 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，降低VECs細(xì)胞活力和細(xì)胞周期 G1/S轉(zhuǎn)換，伴 p21 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)及 Ras