高氮無鎳不銹鋼金屬支架材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、目的:
　　 自從20世紀(jì)80年代將金屬支架用于冠狀動脈介入治療后，在冠狀動脈內(nèi)植入支架治療已經(jīng)成為最主要的治療冠心病的模式。但是支架植入成功6個月后仍會有20％-30％的再狹窄發(fā)生。316L和317L作為目前應(yīng)用最為廣泛的冠狀動脈內(nèi)不銹鋼金屬支架材料，其通常含有10％-14％的鎳元素，研究認(rèn)為316L和317L不銹鋼金屬支架材料中鎳元素的離子釋放引起的接觸過敏加重了炎癥反應(yīng)，刺激支架周圍的新生組織的增生，因而增大了再狹窄的可能

2、性。因此目前正在開發(fā)的一種新型高氮無鎳（High nitrogen nickel free，HNNF）不銹鋼金屬支架材料，旨在通過去掉鎳元素降低鎳離子的潛在危害性及動脈支架內(nèi)再狹窄率。本研究旨在探究HNNF不銹鋼金屬支架材料與316L不銹鋼金屬支架材料對人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長的影響，從而為降低鎳離子的潛在危害性和血管支架內(nèi)再狹窄率以及新型不銹鋼金屬支架材料的研發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗資料和理論依據(jù)。本實(shí)驗通過研究HNNF不銹鋼金屬支架材料

3、和316L不銹鋼金屬支架材料對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)和人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞（Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cell，HUASMC）的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞的生長活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)等方面的影響，為探究血管支架內(nèi)再狹窄機(jī)制，新型支架材料的研發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗材料與方法:

4、r>　　 一、細(xì)胞粘附的測定
　　 將培養(yǎng)的HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于置有316L和HNNF兩種不銹鋼金屬材料的24孔培養(yǎng)板中，并設(shè)有正常培養(yǎng)細(xì)胞的對照組。各組均用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。培養(yǎng)4h后取出樣本，PBS液沖洗，去除未粘附細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化后收集，臺盼藍(lán)染色后，倒置顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，計算相對于對照組細(xì)胞的細(xì)胞粘附百分比。
　

5、　 二、觀察細(xì)胞生長狀況
　　 將體外培養(yǎng)的HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，將24孔培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3天和7天，待細(xì)胞基本長成單層，取出長有細(xì)胞的金屬片，用姬姆薩染液進(jìn)行細(xì)胞染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞在兩種不銹鋼金屬材料表面上的細(xì)胞生長狀況。用Calcein AM染液進(jìn)行細(xì)胞染色，置于熒光顯微鏡下觀察HUVEC和HUASMC兩種

6、細(xì)胞在兩種不銹鋼金屬材料表面上的細(xì)胞生長狀況。從形態(tài)上觀察HNNF和316L兩種不銹鋼金屬材料對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞生長狀況的影響。
　　 三、細(xì)胞生長活性的測定
　　 取對數(shù)生長期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，將24孔培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，各組均在開始培養(yǎng)后的1、3、5、7天取樣，通過CCK-8比色法測定細(xì)胞的生長活性，用酶聯(lián)免疫檢測儀于4

7、50nm波長處測定每孔的OD值，求出每一組的平均OD值。計算細(xì)胞的相對增殖率(relative growth rate，RGR): RGR=（實(shí)驗組OD值/對照組OD值）×100％，對各組結(jié)果進(jìn)行評價。定量分析316L和HNNF兩種不銹鋼金屬材料對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞的細(xì)胞增殖及細(xì)胞生長活性的影響。
　　 四、細(xì)胞生長曲線的測定
　　 取對數(shù)生長期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組

8、24孔培養(yǎng)板中，將24孔培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，各組均在開始培養(yǎng)后的7天內(nèi)連續(xù)收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并通過臺盼藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 五、細(xì)胞周期分析
　　 取對數(shù)生長期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，將各組細(xì)胞均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組細(xì)胞均在開始培養(yǎng)7天后用不含血清的新鮮培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)22h，再更換為含有10

9、％胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在不同時間點(diǎn)分別取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。定量分析316L和HNNF兩種不銹鋼金屬支架材料對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　 六、細(xì)胞凋亡檢測
　　 取處于對數(shù)生長期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種子各組6孔培養(yǎng)板中，將各組細(xì)胞置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于離心管

10、中通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。定量分析316L和HNNF兩種不同不銹鋼金屬支架材料對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響。
　　 七、實(shí)時定量PCR檢測
　　 取處于對數(shù)生長期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記。按照TRIzol說明書的要求提取RNA，測定

11、各組RNA純度和濃度。按照Takara說明書的要求，反轉(zhuǎn)錄得到DNA模板，然后按照Takara說明書的要求進(jìn)行Real-Time PCR的檢測。以基因GAPDH作為內(nèi)參，定量分析316L和HNNF兩種不銹鋼金屬支架材料對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞基因水平表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、通過鏡下對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目的觀察、CCK-8實(shí)驗對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞增殖活

12、性的檢測和流式細(xì)胞儀對HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞周期的檢測可以看出培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞其細(xì)胞生長水平低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞(p＜0.05)，但高于HUVEC細(xì)胞在體外培養(yǎng)的正常水平(p＜0.05);培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其生長水平低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的細(xì)胞(p＜0.05)，同時也低于HUASMC細(xì)胞在體外培養(yǎng)的正常水平(p＜0.05)

13、。
　　 2、通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡的檢測可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞在培養(yǎng)7天后其細(xì)胞早期凋亡的比例比培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞比例高。培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞在培養(yǎng)7天后其細(xì)胞早期凋亡的比例比培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料材料上的HUASMC細(xì)胞比例高。
　　 3、通過實(shí)時定量PCR的結(jié)果可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞其與凋

14、亡相關(guān)的基因和與自噬相關(guān)的基因表達(dá)水平比培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞值高(p＜0.05)，說明316L不銹鋼金屬材料比HNNF不銹鋼金屬材料可能更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果一致。
　　 4、培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞其基因Fas，caspase-8和caspase-3的mRNA水平的上調(diào)說明從316L不銹鋼金屬材料釋放出的鎳離子可能通過Fas基因介導(dǎo)的外源凋亡途徑誘導(dǎo)了HUVEC細(xì)

15、胞的細(xì)胞凋亡。
　　 5、通過實(shí)時定量PCR的結(jié)果可以看出培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其與凋亡相關(guān)的基因和與自噬相關(guān)的基因表達(dá)水平比培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞值高(p＜0.05)，說明HNNF不銹鋼金屬材料比316L不銹鋼金屬材料可能更易誘導(dǎo)HUASMC細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，提示HNNF不銹鋼金屬材料比316L不銹鋼金屬材料可能更易抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，與HUASMC細(xì)胞細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果

16、一致。
　　 6、培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其基因Fas、caspase-8、caspase-3和caspase-9的mRNA水平較培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其相應(yīng)基因mRNA水平上調(diào)，說明HNNF不銹鋼金屬材料可能通過Fas基因介導(dǎo)的外源凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源途徑兩種途徑誘導(dǎo)了HUASMC細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過細(xì)胞形態(tài)的觀察、細(xì)胞生長活性、

17、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的檢測以及實(shí)時定量PCR的檢測，發(fā)現(xiàn)HNNF不銹鋼金屬支架材料同對照組相比具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。
　　 2、與316L不銹鋼金屬支架材料相比，HNNF不銹鋼金屬支架材料具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，同時由于其不含有鎳元素，從而降低了316L不銹鋼金屬支架材料中鎳元素對細(xì)胞的潛在毒性作用。
　　 3、本實(shí)驗的實(shí)驗結(jié)果為降低血管支架內(nèi)再狹窄以及新型HNNF不銹鋼金屬支架材料的開發(fā)應(yīng)用提供了實(shí)驗