前列腺組織中雄激素受體亞型產(chǎn)生機(jī)制、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其作用的研究.pdf

1、本文對(duì)前列腺gt織中雄激素受體亞型產(chǎn)生機(jī)制、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其作用進(jìn)行了研究。 一、研究背景 前列腺是人體內(nèi)唯一保持終生生長(zhǎng)，而且終生依賴雄激素的器官。雄激素在前列腺的生長(zhǎng)發(fā)育和前列腺增生(BPH，benignprostatehyperplasia)、前列腺癌(PCa，prostaticcancer)的發(fā)病過(guò)程中均起著重要作用。雄激素只有和特異性的雄激素受體AR(androgenreceptor)結(jié)合才能發(fā)揮作用。長(zhǎng)期以來(lái)，人

2、們一直認(rèn)為AR是單一基因編碼的單一蛋白，但大量的生理和病理現(xiàn)象很難用單一的AR來(lái)解釋。 已經(jīng)在很多動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不同結(jié)構(gòu)和功能的AR亞型。在Atlanticcroaker和kelpbass中人們也已證實(shí)存在兩種AR亞型，且分別傾向于與睪酮(T，testosterone)或雙氫睪酮(DHT,dihydrotestosterone)結(jié)合，這是人們首次證實(shí)在同一個(gè)生物體內(nèi)共存兩種分別和T及DHT結(jié)合的AR亞型。有關(guān)人類AR亞型的研究還

3、比較少，但人們?cè)谌梭w的多種組織和器官中均已證實(shí)了不同結(jié)構(gòu)和功能的亞型。Wilson等人在人會(huì)陰皮膚的成纖維母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)存在兩種不同的AR蛋白，命名為AR-A、AR-B；在對(duì)結(jié)腸癌的研究中，人們也已證實(shí)在結(jié)腸癌中存在兩種不同的AR亞型表達(dá)，而且亞型表達(dá)的變化可能是結(jié)腸的發(fā)病因素之一。尤其是人們近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一種全新的AR，它有別于做為核轉(zhuǎn)錄因子的AR，位于細(xì)胞膜上，結(jié)構(gòu)和功能與普通AR完全不同，現(xiàn)已證明在體內(nèi)大多數(shù)組織中均有其表達(dá)。

4、這些研究有力的證實(shí)了AR亞型在人體內(nèi)不但存在，而且介導(dǎo)不同的功能。對(duì)于前列腺這個(gè)終生依賴雄激素而且?guī)缀踅K生增長(zhǎng)，但對(duì)T和DHT又有不同反應(yīng)性的器官來(lái)說(shuō)，AR亞型的研究就更為重要。但是涉及前列腺中AR亞型的研究很少。 在前期的工作中，我們對(duì)前列腺中雄激素受體亞型進(jìn)行了研究論證，用放射性元素氚標(biāo)記的DHT與AR結(jié)合進(jìn)行等點(diǎn)聚焦電泳(IEF電泳)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在正常的前列腺組織中存在四個(gè)不同等電點(diǎn)的AR亞型表達(dá)，而且在正常前列腺的帶性結(jié)

5、構(gòu)和病理性的前列腺組織中，AR亞型表現(xiàn)出不同的分布特征。但前列腺中雄激素受體亞型的結(jié)構(gòu)特征和產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚。 AR和孕激素受體(PR，progesteronereceptor)、糖皮質(zhì)激素受體(GR，glucocorticoidreceptor)、鹽皮質(zhì)激素受體(MR，mineralocorticoidreceptor)和雌激素受體(ER，estrogenreceptor)均屬于核受體超家族，在這一家族成員的研究中人們發(fā)現(xiàn)，亞

6、型產(chǎn)生的機(jī)制主要有兩種，一是由不同基因分別編碼，如ER—Q和ER-β，二是由同一基因編碼，但在轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中不同的起始位點(diǎn)或剪切修飾所致，如PR-A和PR-B；還有一些兩者都有，如ER．Q又存在多種異構(gòu)體。這些不同結(jié)構(gòu)的亞型，介導(dǎo)不同的生理功能。PR、ER等其它甾體激素受體亞型的研究發(fā)現(xiàn)，亞型的表達(dá)有組織特異性，在不同組織和細(xì)胞中，亞型的表達(dá)并不相同。 本課題擬進(jìn)一步驗(yàn)證AR亞型在前列腺中的表達(dá)，并根據(jù)上述機(jī)制應(yīng)用現(xiàn)代分子生物

7、學(xué)的方法對(duì)前列腺中AR亞型的產(chǎn)生機(jī)制以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行研究，就AR亞型在正常前列腺、BPH中表達(dá)特點(diǎn)及在前列腺生長(zhǎng)發(fā)育和BPH發(fā)病中的作用進(jìn)行探討。 二、研究目的 1、進(jìn)一步驗(yàn)證前列腺組織中雄激素受體亞型的表達(dá)，并參照甾體激素受體家族亞型可能的產(chǎn)生機(jī)制，應(yīng)用分子生物學(xué)的方法對(duì)前列腺組織中AR亞型的產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行探索，進(jìn)一步明確AR亞型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 2、明確在前列腺中發(fā)現(xiàn)的AR亞型是否在其它雄激素依賴的器官普遍表達(dá)，探

8、索AR亞型在男性生殖系統(tǒng)的分布規(guī)律。 3、探索AR及其亞型在前列腺組織中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)AR及其亞型在前列腺階段性生長(zhǎng)以及BPH發(fā)病中的作用進(jìn)行探討。 三、研究方法 我們分別選擇正常前列腺19例(平均26．7歲，取自器官捐獻(xiàn)者)，前列腺增生組織20例(平均68．9歲，取自經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù))，LNCaP細(xì)胞進(jìn)行研究。 1、我們選擇分別針對(duì)AR蛋白N端和C末端的特異性抗體，通過(guò)WesternBlot對(duì)前列腺

9、組織中AR亞型的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；通過(guò)涵蓋AR所有8個(gè)外顯子的引物進(jìn)行RT-PCR，以對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可能的外顯子拼接變異進(jìn)行檢測(cè)；應(yīng)用NorthernBlot檢測(cè)因不同起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄或剪切等造成的mRNA分子的變異。 2、對(duì)于在前列腺中發(fā)現(xiàn)的AR亞型，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)在泌尿生殖系統(tǒng)的分布規(guī)律。 3、通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)正常前列腺移行帶和外周帶、BPH組織中，AR和TGF．B1mRNA的表達(dá)分布特征，應(yīng)用We

10、sternBlot檢測(cè)AR亞型在各種前列腺組織中的表達(dá)特點(diǎn)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法研究AR在前列腺基質(zhì)和上皮中的分布規(guī)律。 四、結(jié)果 1、在前列腺組織和LNCaP細(xì)胞中，我們通過(guò)WesternBlot，發(fā)現(xiàn)三個(gè)不同大小的AR蛋白分子，分子量依次為110KD、95KD、87KD。其中110KD的AR可以被兩組抗體識(shí)別；87KD能被針對(duì)C末端的抗體識(shí)別，但不能被針對(duì)N端的抗體識(shí)別，說(shuō)明它缺少完整的N端結(jié)構(gòu)；95KD的AR缺少完整

11、的C末端，僅能被針對(duì)N端的抗體識(shí)別。110KD和87KD的亞型在正常前列腺和BPH以及LNCaP細(xì)胞中均有表達(dá)，但95KD僅見(jiàn)于LNCaP細(xì)胞中微弱表達(dá)。RT-PCR未發(fā)現(xiàn)變異條帶出現(xiàn)，說(shuō)明在AR基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，沒(méi)有外顯子的脫漏或重復(fù)。NorthernBlot亦未發(fā)現(xiàn)新的變異條帶，說(shuō)明前列腺中沒(méi)有ARmRNA的異常剪切或不同起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄。那么，免疫印跡雜交發(fā)現(xiàn)的三個(gè)亞型均來(lái)自同一個(gè)mRNA分子，110KD的AR是全長(zhǎng)翻譯的結(jié)果，87

12、KD缺少N端的部分序列，95KD則缺少C末端的部分氨基酸序列。 2、在男性泌尿生殖系統(tǒng)中，可以檢測(cè)到110KD和87KD的亞型普遍表達(dá)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)95KD的AR。在胚胎發(fā)育過(guò)程中依賴DHT的尿生殖竇原基分化來(lái)的外生殖器，如陰莖、陰囊、尿道，和依賴T分化的附睪、輸精管、精囊中AR亞型的表達(dá)規(guī)律相似，均是以110KD的AR表達(dá)為主。在膀胱腫瘤組織和正常膀胱粘膜組織中均能檢測(cè)到110KD、87KD的亞型，在腫瘤組織中87KD／110K

13、D的比值大于正常粘膜組織，但兩者差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(非參數(shù)秩和檢驗(yàn)u=1．68，p：0．09)。 3、在本組正常前列腺中，外周帶的AR表達(dá)高于移行帶，但兩種AR亞型的相對(duì)表達(dá)保持平衡，87KD／110KD的比值在兩帶間沒(méi)有顯著性差異，而且AR在兩帶間均是以上皮表達(dá)為主，基質(zhì)問(wèn)的AR表達(dá)陽(yáng)性率沒(méi)有差異，TGF-B1則在移行帶的表達(dá)高于外周帶，這與它的表達(dá)受雄激素負(fù)性調(diào)控相吻合。在BPH組織中，AR和TGF-B1均明顯升高，尤其是8

14、7KD／110KD的比值升高，提示87KD的表達(dá)增加，亞型間的表達(dá)平衡出現(xiàn)變化，改變了BPH組織的激素反應(yīng)性。AR及其亞型的變化，與TGF-61一起共同刺激基質(zhì)和上皮細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)了BPH的發(fā)生發(fā)展。 五、結(jié)論 1、我們通過(guò)SDS-PAGE電泳和免疫印跡雜交，進(jìn)一步證實(shí)在前列腺組織和LNCaP細(xì)胞中，存在不同結(jié)構(gòu)的AR亞型表達(dá)，分子量依次為110KD、95KD、87KD。根據(jù)針對(duì)AR蛋白兩端序列的抗體的識(shí)別特點(diǎn)，以

15、及RT-PCR和NorthernBlot的結(jié)果我們可以推斷，上述亞型均來(lái)自同一個(gè)mRNA分子，亞型的產(chǎn)生來(lái)自轉(zhuǎn)錄后水平，而且AR基因中間六個(gè)外顯子編碼的肽段序列在三者間完全相同，其結(jié)構(gòu)上的差別僅在于兩端的氨基酸殘基。其中，110KD是全長(zhǎng)翻譯的結(jié)果；而87KD的亞型結(jié)構(gòu)上與成纖維母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的AR-A相同，由內(nèi)在的起始位點(diǎn)翻譯而來(lái)，缺少完整的N端；而95KD則缺少完整的C末端，可能是翻譯過(guò)程中的剪切所致。我們前期通過(guò)IEF電泳所發(fā)現(xiàn)的四

16、個(gè)不同等電點(diǎn)的AR，可能是在磷酸化的結(jié)果。而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的位于細(xì)胞膜上的AR，已被證實(shí)它在前列腺中表達(dá)，那么我們前期的的放射性配體結(jié)合的IEF電泳極可能也包括了這一個(gè)AR家族的新成員。 2、在雄激素依賴的男性生殖系統(tǒng)中，可以發(fā)現(xiàn)110KD、87KD的AR亞型普遍表達(dá)，但是在各器官中的分布規(guī)律相似，均是以110KD為主，并沒(méi)有出現(xiàn)類似ER亞型在女性生殖系統(tǒng)中，由外到內(nèi)，ER．Q逐漸增多而ER-β逐漸減少的分布規(guī)律。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，

17、附睪、輸精管和精囊的發(fā)育可以直接依賴睪酮的作用，而陰莖等則必須依賴DHT的作用，本組結(jié)果中亞型表達(dá)規(guī)律類似，還不能解釋這一現(xiàn)象，但本組選擇的均是發(fā)育成熟的組織，不能完全代表胚胎發(fā)育過(guò)程過(guò)程中AR亞型的表達(dá)。 3、前列腺組織中AR及其亞型的表達(dá)特征的變化，導(dǎo)致組織對(duì)雄激素反應(yīng)性發(fā)生改變，這可能是前列腺階段性生長(zhǎng)和BPH發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)之一：在第一個(gè)快速增長(zhǎng)期，外周帶的AR高表達(dá)和TGF-B1低表達(dá)可能是這種以外周帶生長(zhǎng)為主增長(zhǎng)模式的