前列腺組織中雄激素受體亞型產(chǎn)生機制、結構特點及其作用的研究.pdf

1、本文對前列腺gt織中雄激素受體亞型產(chǎn)生機制、結構特點及其作用進行了研究。 一、研究背景 前列腺是人體內唯一保持終生生長，而且終生依賴雄激素的器官。雄激素在前列腺的生長發(fā)育和前列腺增生(BPH，benignprostatehyperplasia)、前列腺癌(PCa，prostaticcancer)的發(fā)病過程中均起著重要作用。雄激素只有和特異性的雄激素受體AR(androgenreceptor)結合才能發(fā)揮作用。長期以來，人

2、們一直認為AR是單一基因編碼的單一蛋白，但大量的生理和病理現(xiàn)象很難用單一的AR來解釋。 已經(jīng)在很多動物體內發(fā)現(xiàn)了不同結構和功能的AR亞型。在Atlanticcroaker和kelpbass中人們也已證實存在兩種AR亞型，且分別傾向于與睪酮(T，testosterone)或雙氫睪酮(DHT,dihydrotestosterone)結合，這是人們首次證實在同一個生物體內共存兩種分別和T及DHT結合的AR亞型。有關人類AR亞型的研究還

3、比較少，但人們在人體的多種組織和器官中均已證實了不同結構和功能的亞型。Wilson等人在人會陰皮膚的成纖維母細胞中發(fā)現(xiàn)存在兩種不同的AR蛋白，命名為AR-A、AR-B；在對結腸癌的研究中，人們也已證實在結腸癌中存在兩種不同的AR亞型表達，而且亞型表達的變化可能是結腸的發(fā)病因素之一。尤其是人們近年來發(fā)現(xiàn)一種全新的AR，它有別于做為核轉錄因子的AR，位于細胞膜上，結構和功能與普通AR完全不同，現(xiàn)已證明在體內大多數(shù)組織中均有其表達。

4、這些研究有力的證實了AR亞型在人體內不但存在，而且介導不同的功能。對于前列腺這個終生依賴雄激素而且?guī)缀踅K生增長，但對T和DHT又有不同反應性的器官來說，AR亞型的研究就更為重要。但是涉及前列腺中AR亞型的研究很少。 在前期的工作中，我們對前列腺中雄激素受體亞型進行了研究論證，用放射性元素氚標記的DHT與AR結合進行等點聚焦電泳(IEF電泳)，結果發(fā)現(xiàn)：在正常的前列腺組織中存在四個不同等電點的AR亞型表達，而且在正常前列腺的帶性結

5、構和病理性的前列腺組織中，AR亞型表現(xiàn)出不同的分布特征。但前列腺中雄激素受體亞型的結構特征和產(chǎn)生機制尚不清楚。 AR和孕激素受體(PR，progesteronereceptor)、糖皮質激素受體(GR，glucocorticoidreceptor)、鹽皮質激素受體(MR，mineralocorticoidreceptor)和雌激素受體(ER，estrogenreceptor)均屬于核受體超家族，在這一家族成員的研究中人們發(fā)現(xiàn)，亞

6、型產(chǎn)生的機制主要有兩種，一是由不同基因分別編碼，如ER—Q和ER-β，二是由同一基因編碼，但在轉錄和翻譯過程中不同的起始位點或剪切修飾所致，如PR-A和PR-B；還有一些兩者都有，如ER．Q又存在多種異構體。這些不同結構的亞型，介導不同的生理功能。PR、ER等其它甾體激素受體亞型的研究發(fā)現(xiàn)，亞型的表達有組織特異性，在不同組織和細胞中，亞型的表達并不相同。 本課題擬進一步驗證AR亞型在前列腺中的表達，并根據(jù)上述機制應用現(xiàn)代分子生物

7、學的方法對前列腺中AR亞型的產(chǎn)生機制以及結構特點進行研究，就AR亞型在正常前列腺、BPH中表達特點及在前列腺生長發(fā)育和BPH發(fā)病中的作用進行探討。 二、研究目的 1、進一步驗證前列腺組織中雄激素受體亞型的表達，并參照甾體激素受體家族亞型可能的產(chǎn)生機制，應用分子生物學的方法對前列腺組織中AR亞型的產(chǎn)生機制進行探索，進一步明確AR亞型的結構特點。 2、明確在前列腺中發(fā)現(xiàn)的AR亞型是否在其它雄激素依賴的器官普遍表達，探

8、索AR亞型在男性生殖系統(tǒng)的分布規(guī)律。 3、探索AR及其亞型在前列腺組織中的表達規(guī)律，對AR及其亞型在前列腺階段性生長以及BPH發(fā)病中的作用進行探討。 三、研究方法 我們分別選擇正常前列腺19例(平均26．7歲，取自器官捐獻者)，前列腺增生組織20例(平均68．9歲，取自經(jīng)恥骨上前列腺摘除術)，LNCaP細胞進行研究。 1、我們選擇分別針對AR蛋白N端和C末端的特異性抗體，通過WesternBlot對前列腺

9、組織中AR亞型的表達進行檢測；通過涵蓋AR所有8個外顯子的引物進行RT-PCR，以對轉錄過程中可能的外顯子拼接變異進行檢測；應用NorthernBlot檢測因不同起始位點的轉錄或剪切等造成的mRNA分子的變異。 2、對于在前列腺中發(fā)現(xiàn)的AR亞型，通過WesternBlot檢測在泌尿生殖系統(tǒng)的分布規(guī)律。 3、通過半定量RT-PCR檢測正常前列腺移行帶和外周帶、BPH組織中，AR和TGF．B1mRNA的表達分布特征，應用We

10、sternBlot檢測AR亞型在各種前列腺組織中的表達特點，應用免疫組織化學法研究AR在前列腺基質和上皮中的分布規(guī)律。 四、結果 1、在前列腺組織和LNCaP細胞中，我們通過WesternBlot，發(fā)現(xiàn)三個不同大小的AR蛋白分子，分子量依次為110KD、95KD、87KD。其中110KD的AR可以被兩組抗體識別；87KD能被針對C末端的抗體識別，但不能被針對N端的抗體識別，說明它缺少完整的N端結構；95KD的AR缺少完整

11、的C末端，僅能被針對N端的抗體識別。110KD和87KD的亞型在正常前列腺和BPH以及LNCaP細胞中均有表達，但95KD僅見于LNCaP細胞中微弱表達。RT-PCR未發(fā)現(xiàn)變異條帶出現(xiàn)，說明在AR基因的轉錄過程中，沒有外顯子的脫漏或重復。NorthernBlot亦未發(fā)現(xiàn)新的變異條帶，說明前列腺中沒有ARmRNA的異常剪切或不同起始位點的轉錄。那么，免疫印跡雜交發(fā)現(xiàn)的三個亞型均來自同一個mRNA分子，110KD的AR是全長翻譯的結果，87

12、KD缺少N端的部分序列，95KD則缺少C末端的部分氨基酸序列。 2、在男性泌尿生殖系統(tǒng)中，可以檢測到110KD和87KD的亞型普遍表達，但沒有發(fā)現(xiàn)95KD的AR。在胚胎發(fā)育過程中依賴DHT的尿生殖竇原基分化來的外生殖器，如陰莖、陰囊、尿道，和依賴T分化的附睪、輸精管、精囊中AR亞型的表達規(guī)律相似，均是以110KD的AR表達為主。在膀胱腫瘤組織和正常膀胱粘膜組織中均能檢測到110KD、87KD的亞型，在腫瘤組織中87KD／110K

13、D的比值大于正常粘膜組織，但兩者差異沒有統(tǒng)計學意義(非參數(shù)秩和檢驗u=1．68，p：0．09)。 3、在本組正常前列腺中，外周帶的AR表達高于移行帶，但兩種AR亞型的相對表達保持平衡，87KD／110KD的比值在兩帶間沒有顯著性差異，而且AR在兩帶間均是以上皮表達為主，基質問的AR表達陽性率沒有差異，TGF-B1則在移行帶的表達高于外周帶，這與它的表達受雄激素負性調控相吻合。在BPH組織中，AR和TGF-B1均明顯升高，尤其是8

14、7KD／110KD的比值升高，提示87KD的表達增加，亞型間的表達平衡出現(xiàn)變化，改變了BPH組織的激素反應性。AR及其亞型的變化，與TGF-61一起共同刺激基質和上皮細胞的增殖，從而促進了BPH的發(fā)生發(fā)展。 五、結論 1、我們通過SDS-PAGE電泳和免疫印跡雜交，進一步證實在前列腺組織和LNCaP細胞中，存在不同結構的AR亞型表達，分子量依次為110KD、95KD、87KD。根據(jù)針對AR蛋白兩端序列的抗體的識別特點，以

15、及RT-PCR和NorthernBlot的結果我們可以推斷，上述亞型均來自同一個mRNA分子，亞型的產(chǎn)生來自轉錄后水平，而且AR基因中間六個外顯子編碼的肽段序列在三者間完全相同，其結構上的差別僅在于兩端的氨基酸殘基。其中，110KD是全長翻譯的結果；而87KD的亞型結構上與成纖維母細胞中發(fā)現(xiàn)的AR-A相同，由內在的起始位點翻譯而來，缺少完整的N端；而95KD則缺少完整的C末端，可能是翻譯過程中的剪切所致。我們前期通過IEF電泳所發(fā)現(xiàn)的四

16、個不同等電點的AR，可能是在磷酸化的結果。而近年來發(fā)現(xiàn)的位于細胞膜上的AR，已被證實它在前列腺中表達，那么我們前期的的放射性配體結合的IEF電泳極可能也包括了這一個AR家族的新成員。 2、在雄激素依賴的男性生殖系統(tǒng)中，可以發(fā)現(xiàn)110KD、87KD的AR亞型普遍表達，但是在各器官中的分布規(guī)律相似，均是以110KD為主，并沒有出現(xiàn)類似ER亞型在女性生殖系統(tǒng)中，由外到內，ER．Q逐漸增多而ER-β逐漸減少的分布規(guī)律。在胚胎發(fā)育過程中，

17、附睪、輸精管和精囊的發(fā)育可以直接依賴睪酮的作用，而陰莖等則必須依賴DHT的作用，本組結果中亞型表達規(guī)律類似，還不能解釋這一現(xiàn)象，但本組選擇的均是發(fā)育成熟的組織，不能完全代表胚胎發(fā)育過程過程中AR亞型的表達。 3、前列腺組織中AR及其亞型的表達特征的變化，導致組織對雄激素反應性發(fā)生改變，這可能是前列腺階段性生長和BPH發(fā)生發(fā)展的基礎之一：在第一個快速增長期，外周帶的AR高表達和TGF-B1低表達可能是這種以外周帶生長為主增長模式的