天然抗角蛋白自身抗體在病理性自身免疫中的作用及機制的研究.pdf

1、正常機體內廣泛存在并具有重要的功能，以往的觀點認為其對AID的發(fā)生具有保護作用，特別是利用分泌型IgM缺陷小鼠進行的研究提示NAA在清除凋亡細胞、抑制AID的發(fā)生中具有重要作用。另一方面，有研究認為NAA也可能因為滴度、親和力、特異性等的改變參與了自身免疫病的發(fā)生，并加速自身免疫病的進程。目前，關于NAA 和病理性自身抗體的區(qū)別以及NAA在病理性自身免疫中的作用是免疫學及相關學科關注的熱點之一。 利用已建立的天然抗角蛋白自身抗體

2、轉基因小鼠(anti-keratin autoantibody，AK auto Ab)，對AK auto Ab的病理意義進行了初步分析。本研究組對NAA家族之一的AK auto Ab進行了多年細致、深入地研究，明確了AK auto Ab的諸多特性。在此基礎上，應用未免疫小鼠B細胞與骨髓瘤細胞融合，成功篩選到了分泌AK auto Ab的雜交瘤3B4；在隨后的實驗中，發(fā)現3B4由未突變的胚系基因編碼，具有廣泛的多反應性，符合NAA的特性；通

3、過克隆AK auto Ab的可變區(qū)基因構建了轉基因（Tg）小鼠，為進一步研究NAA的產生機制、功能意義等問題提供了良好的實驗平臺。我們共獲得了3系具有較高血清AK auto Ab滴度的Tg小鼠，每系均具有相似的表型。本研究對常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境下39系20周齡以上小鼠的表型變化進行了系統而全面的分析，為闡明NAA可能的病理意義進行積極的探索。 一、常規(guī)環(huán)境下AK auto Ab 重鏈Tg小鼠的表型分析 1．AK auto Ab

4、Tg小鼠基因型的鑒定、傳代、篩選和維持根據本研究小組前期實驗所設計的兩對引物對小鼠基因型進行鑒定。第一對引物應該擴增出460bp條帶；而第二對引物應該擴增出200bp條帶。實驗證明第二對引物特異性較強。ELISA法檢測小鼠血清中的抗角蛋白IgM滴度和總IgM 滴度，最終選擇了抗角蛋白IgM水平顯著增高的39系轉基因小鼠進行進一步研究。 2．AK auto Ab Tg小鼠的大體表現在20周齡前，Tg小鼠與同窩對照（WT）小鼠表型無

5、明顯差別。20周齡以后，Tg小鼠逐漸出現病態(tài)表現：明顯消瘦，頸椎前突，弓背畸形，體毛皺褶，攝食減少，活動能力差，生存時間縮短，體重減輕明顯；脾大，臟器與體重比增大，尤其以雌性小鼠更為常見。 3. AK auto Ab Tg小鼠相關實驗室檢查 ①血常規(guī)和血生化。由尾靜脈和眼球靜脈取血，分別在全自動血球分析儀和生化分析儀上檢測血常規(guī)和血生化。血常規(guī)示Tg小鼠血小板（PLT）計數升高，淋巴細胞絕對值（LYMF）降低，白細胞總數

6、（WBC）降低，中性粒細胞百分比（GPR）升高，血小板壓積（PCT）增大；血生化示總蛋白(TP)升高，尿素氮(BUN)升高，血糖(GLU)降低，而且具有統計學差異，表明Tg小鼠出現了腎功能不全，發(fā)生了自身免疫性損傷。 ②抗體重鏈Tg小鼠尿液分析。取小鼠尿液，經Bradford法定量后，在SDS-PAGE上進行尿蛋白電泳。結果發(fā)現與WT小鼠相比，尿蛋白含量增高，電泳以混合性蛋白尿為主，其結果提示腎臟病變主要位于腎小球。 ③

7、抗體重鏈Tg小鼠組織學檢查。取小鼠的脾、肝、腎、腸、肺、皮膚、骨骼肌、胃、股骨等重要器官組織進行切片及相關染色分析。目前發(fā)現主要病變在腎臟，Tg小鼠可見腎小球系膜細胞和系膜基質增生，基底膜增厚，毛細血管內微血栓形成，腎小球數量明顯減少，近曲小管擴張，遠曲小管上皮細胞變性，間質內可見明顯的炎癥細胞浸潤，而WT小鼠腎小球結構正常。PAS染色顯示基底膜肥厚。免疫熒光示Tg小鼠腎小球內可見明顯的IgM類顆粒狀熒光物質沉積，主要集中在系膜區(qū)，熒光

8、強度在（++～+++），WT小鼠只能見到微弱的熒光，強度為（?～+）；整個腎小球內未見IgG類物質沉積。電鏡發(fā)現Tg小鼠腎小球系膜區(qū)系膜細胞、系膜基質增生明顯，足突細胞廣泛融合，可見變性，基底膜有不規(guī)則增厚，偶見分離和雙軌征。以上結果提示Tg小鼠可能患有自身免疫性疾病，尤以腎臟病變?yōu)橹亍?二、不同飼養(yǎng)環(huán)境對AK auto Ab Tg小鼠B細胞發(fā)育的影響 1．Tg小鼠轉入無菌區(qū)常規(guī)環(huán)境中經鑒定的Tg小鼠，在SPF環(huán)境中行剖

9、宮產術，其子代在此環(huán)境中飼養(yǎng)、鑒定、傳代以備下一步觀察和分析。 2．AK auto Ab Tg小鼠B細胞發(fā)育分析取不同飼養(yǎng)環(huán)境中的小鼠的骨髓、脾臟、腹腔和淋巴結，通過流式細胞儀檢測骨髓中不同發(fā)育階段的B細胞、脾臟中邊緣帶B（MZ/B）細胞、濾泡B（Fo/B）細胞以及未成熟B細胞、腹腔內分泌NAA的CD5+B1細胞的存在數量和比例，并進一步分析其等位基因排斥及T、B細胞分布情況。我們未發(fā)現不同飼養(yǎng)環(huán)境中細胞數量和比例存在明顯差別，

10、結果提示環(huán)境因素對Tg小鼠B細胞的發(fā)育影響不大。 本實驗分析了在常規(guī)環(huán)境中Tg小鼠的表型變化，比較了不同飼養(yǎng)環(huán)境中的感染因素對Tg小鼠B細胞發(fā)育的作用，結果提示了天然自身抗體的過度表達對機體多系統、多器官產生重要影響；Tg小鼠有發(fā)生自身免疫性疾病的傾向，其中腎臟病變尤為突出，但它是否為小鼠的致死原因仍需進一步的研究和論證。外源感染很可能加速了疾病的進程但是對B細胞的發(fā)育影響不大。 天然自身抗體(natural autoa

11、ntibodies，NAA)是在沒有任何抗原免疫的情況下，正常機體產生的針對一種或多種自身抗原的抗體，其廣泛存在及其功能意義的闡明表明一種生理性自身免疫機制的存在。因此，目前把自身免疫分為生理性自身免疫和病理性自身免疫。前者是指自身免疫反應在一定限度內，不造成機體損傷和功能障礙，其中NAA是生理性自身免疫的主體，在機體抗感染、免疫調節(jié)、腫瘤監(jiān)視、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持等方面發(fā)揮著積極的作用；后者即自身免疫性疾?。╝utoimmune dise