金葡素注射液中質(zhì)控指標SEC含量檢測方法的建立及相關腸毒素生物學活性的初步研究.pdf

1、超抗原是指一類逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白和細菌毒素，它們無需抗原遞呈細胞的加工，可直接與抗原遞呈細胞的MHCII及T細胞表面的TCR結(jié)合并激活T細胞。由于極微少的量即可以激活大量的T細胞，因而稱之為超抗原。作為一類超抗原蛋白，腸毒素(sEs)能對人體免疫系統(tǒng)同時產(chǎn)生急性和長效的作用：急性作用包括食物中毒和中毒性休克；長效作用則包括自體免疫疾病和免疫缺陷如遺傳性過敏癥、川崎病等。但是如果利用得當，腸毒素就能刺激機體白細胞大量增殖從而加強免疫應答，增強

2、機體免疫力；而且可對腫瘤細胞產(chǎn)生超抗原依賴的細胞毒作用，從而產(chǎn)生機體的抗腫瘤反應。 在我國，金黃色葡萄球菌濾液制劑作為腫瘤放化療治療的輔助藥物應用于臨床已有十年，目前臨缶床上使用的抗腫瘤金葡素注射制劑主要有沈陽協(xié)合生物制藥股份有限公司生產(chǎn)的高聚生，浙江耀江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的恩格菲和杭州國光藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的思復勝。 沈陽協(xié)和生物制藥股份有限公司提出金葡素制劑的可能活性成分為SEC，并建立了一個用于sEC含量檢測的ELIs

3、A檢測方法，臨床上其他的金葡素制劑亦以sEc的標示量作為該制剡的質(zhì)量控制標準，而且是唯——個標明具體含量的成分。雖然目前金葡菌濾液制劑已取得了廣泛的應用，并在臨床上證明安全有效，但由于該類型的制劑都是由金葡菌分泌上清所得，制劑中存在著大量的蛋白質(zhì)以及多肽類雜質(zhì)，成分復雜，而且沒有可靠可信的研究確定其真正的有效成分，在用藥安全和質(zhì)量控制上存在著很多問題。 首先，假設sEC是金葡素制劑中的活性成分，協(xié)和生物制藥公司的sEC檢測試劑盒

4、并沒有在市面上銷售，其可信性和準確性都難以驗證。目前臨床上使用的金葡素制劑中SEC確切的含量事實上仍不可知，并且缺乏產(chǎn)品問批次間SEC確切含量的質(zhì)量控制標準。臨床上對各廠家的產(chǎn)品在治療的安全性和治療效果的差異方面也沒有具體的對比數(shù)據(jù)。為避免超抗原激活全身大量T細胞而引發(fā)機體免疫功能紊亂，并導致多種急慢性、自身免疫性疾病產(chǎn)生危險，劑量和給藥途徑是臨床應用的關鍵。因此，亟需建立嚴格可控的質(zhì)量標準，一種靈敏、快速、簡易的定性定量地檢測腸毒素的

5、方法不僅能作為食物中毒和獲得性感染的檢測手段，更能成為臨床抗腫瘤金葡素制劑生產(chǎn)的新工藝標準和質(zhì)量控制標準，為臨床疾病診斷以及抗腫瘤治療提供良好的工具和手段。其次，SEC是否是真正的有效成分?是唯一的還是與其他成分共同作用的?目前該類型制劑中SEC相對含量極低。標示量都在10ng/ml。制劑中大量的雜蛋白有沒有抗腫瘤活性，或者只是引起毒副作用的因素?到目前為止，已有大約20種腸毒素被發(fā)現(xiàn)，其中包括SEA、SEB、SEC1-3，SED和SE

6、E等經(jīng)典腸毒素型和后來發(fā)現(xiàn)的SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK以及新發(fā)現(xiàn)的SEM、SEN、SEO和SEU等等。金葡菌腸毒素家族有著類似的活性，但不同的血清型在作用位點、具體作用機制上也不同的方式。金葡素制劑中是否還含有其他類型的腸毒素，與SEC共同作用?腸毒素之間是否存在著協(xié)同作用?是否存在活性和安全性較SEC更高的腸毒素或者腸毒素的組合?隨著越來越多的腸毒素的發(fā)現(xiàn)，如何篩選、組合和開發(fā)金葡菌腸毒素，以求減少在使用過程中產(chǎn)生的毒副作

7、用并增強抑制腫瘤的療效，也是一個亟待解決的課題。 為實現(xiàn)上述目標，本研究設計了如下實驗方案：一方面，針對金葡素制劑質(zhì)量控制方面的問題，開發(fā)一種臨床適用的SEC ELISA檢測方法；另一方面，通過建立一種腸毒素體外活性篩選模型對金葡素制劑以及相關腸毒素的活性進行初步的比較研究。 在SEC ELISA檢測方法的建立上，首先選擇本實驗室以基因工程的方法克隆表達純化得到的具有生物學活性的兩種重組腸毒素C2蛋白為免疫原分別免疫BA

8、LB/c小鼠和新西蘭大白兔，獲得單克隆抗體和多克隆抗體；其次使用這兩種抗體建立起敏感快速的雙抗體夾心ELISA法；再次，在此雙抗體夾心ELISA法的基礎上，引入生物素一鏈霉親合素系統(tǒng)，最后建立起一種適用于抗腫瘤藥物金葡素注射液質(zhì)控指標SEC含量檢測的生物素一鏈霉親和素酶聯(lián)免疫吸附方法(BA—ELISA)。在腸毒素活性研究方面，首先建立腸毒素活性研究的體外初篩模型；其次，使用該模型對高聚生、恩格菲兩種金葡素注射液以及本實驗室制備的多種腸毒

9、素增殖小鼠脾淋巴細胞的活性進行了比較；再次，進一步兩兩等質(zhì)量比混用多種腸毒素，對各血清型的腸毒素之間可能存在的協(xié)同作用進行初步的探索，為進一步篩選和開發(fā)高效低毒的腸毒素藥物提供依據(jù)。 A．金葡素注射液中質(zhì)控指標SEC含量檢測方法的建立 1．腸毒素SEC2蛋白多克隆抗體、單克隆抗體的制備、鑒定及純化1.1腸毒素sEC2蛋白多克隆抗體的制備和鑒定將帶有6個組氨酸標記的SEC2-His蛋白按比例與福氏佐劑混合，新西蘭大白兔背部

10、皮下多點注射免疫，共免疫四次后，在兔耳緣靜脈取血，瓊脂糖免疫雙擴散法測定其抗體效價為l：8，間接ELISA法測定抗體免疫效價為l：4×106．并用Western blotting法鑒定其特異性。從兔心臟穿刺取血，收集抗體血清。1．2多克隆抗體的純化采用辛酸一硫酸銨法兩步純化多克隆抗體。先用辛酸除去大量血清中的白蛋白，調(diào)整好pH值后加入固體硫酸銨，取沉淀溶于一定量的透析液中，并在透析液中透析48h除去硫酸銨。將透析后的蛋白離心去除沉淀雜質(zhì)

11、，即可得到較純的抗體蛋白。 13腸毒素sEc2蛋白單克隆抗體的篩選經(jīng)過多次篩選和有限稀釋，在本實驗室保存的五株單克隆抗體細胞中選擇出效價最高的202雜交瘤細胞株。天然金葡菌分泌的SEC2蛋白作為抗原包被酶標板，雜交瘤細胞免疫腹水用PBS倍比稀釋后與之結(jié)合用以檢測其效價。測定的結(jié)果表明，202細胞株腹水單抗效價為2×105。1．4單克隆抗體的純化利用IgG能與蛋白A親和結(jié)合的特性，將收集的雜交癌細胞免疫腹水通過蛋白A親和層析柱，緩

12、沖液洗去非特異性吸附的雜蛋白后，用低pH值的緩沖液將結(jié)合在蛋白A親和層析柱上的抗體洗脫下來。由SDS-PAGE結(jié)果可知，己獲得較純的抗體免疫蛋白。 2.SEC蛋白檢測方法的建立 2.1雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立抗SEC2單克隆抗體包被酶標板，以兔抗SEC2多克隆抗體為第二層抗體，形成雙抗體夾心，與抗原SEC2蛋白特異性結(jié)合，再加入標記有辣根過氧化物酶(HRP)的三抗與底物進行顯色測定，建立起一套腸毒素SEC2雙抗體夾心E

13、LISA檢測方法。 2.2生物素一鏈霉親合素ELISA檢測方法的建立在雙抗體夾心ELISA檢測方法的基礎上，引入生物素一鏈霉親合素系統(tǒng)，以擴大反應信號?？筍EC2單克隆抗體包被酶標板作為捕獲抗體，兔抗SEC2多克隆抗體為測定抗體，形成雙抗體夾心，與抗原SEC2蛋白特異性結(jié)合，再加入生物素標記的三抗和標記有辣根過氧化物酶的鏈霉親合素與底物進行顯色測定。建立起一套適用于臨床金葡素注射液SEC含量檢測的BA-ELISA檢測方法。

14、 B．金葡素注射液與相關腸毒素生物學活性的比較研究 1．腸毒素體外活性研究模型的建立選擇野生型腸毒素SEC2(nSEC2)和重組腸毒素SEC2(rSEC2)為研究對象，以ICR小鼠脾淋巴細胞為效應細胞，小鼠黑色素瘤B16細胞、慢性髓原性白血病K562細胞和耐藥慢性髓原性白血病K562-ADM細胞為靶細胞，以有絲分裂原ConA為陽性對照，采用MTT法，選擇適合的條件，建立合適的體外模型來觀察腸毒素對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用以及對

15、腫瘤細胞的體外殺傷活性。 2．單用金葡素注射液及八種金黃色葡萄球菌腸毒索對體外小鼠脾淋巴細胞的增殖作用應用建立的腸毒素體外活性研究模型，對高聚生、恩格菲兩種金葡素注射液以及rSEA/rSEO/rSEM/rSEN/rSEG/rsEC2/nSEC2/rSEI的增殖小鼠脾淋巴細胞的活性進行了比較研究。 3．七種腸毒素兩兩混用對體外小鼠脾淋巴細胞的增殖作用應用建立的腸毒索體外活性研究模型，對兩兩等質(zhì)量比混用七種重組腸毒素rSEA

16、/rSEO/rSEM/rSEN/rSEG/rSEC2/rSEI后對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用進行了實驗，對兩兩等質(zhì)量比混用可能產(chǎn)生的腸毒素之間的協(xié)同作用進行了初步探索。 綜上所述，本課題首先建立了一種適用于金葡素注射液質(zhì)控指標SEC含量檢測的BA-ELISA法，該方法靈敏度高、準確性好、重復性好、特異性高，為二十余種腸毒素分型的定量檢測方法的建立奠定了良好的基礎。應用該方法對三種金葡素注射液中SEC含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中存在著含量

17、與標示量不符的情況：同時，注射液中均含有99.9％以上成分不明的雜蛋白，威脅著用藥安全。其次建立了一種適合腸毒素活性研究的體外初篩模型，應用該模型對兩種金葡素注射液以及八種不同腸毒素的增殖淋巴細胞的活性進行了比較，結(jié)果表明金葡素注射液與SEC2活性相當，提示可以通過基因工程的手段制備高純度的腸毒素制劑代替金葡菌濾液制劑;SEI、SEM、SEN則表現(xiàn)出更高的活性，有望成為抗腫瘤藥物，存在進一步篩選的價值；在此基礎上首次對腸毒素之間可能存在