水溶性脂質(zhì)體運(yùn)載siRNA沉默NMDA受體1治療大鼠神經(jīng)病理性痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)（TheInternationalAssociationfortheStudyofPain，IASP）將疼痛定義為伴隨著組織損傷或潛在的組織損傷并由這種損傷引起的一種不愉快的感覺和情緒體驗(yàn)。慢性疼痛是超過正常組織愈合時(shí)間（三個(gè)月）的疼痛。這類疼痛常常在一定的期間（數(shù)月至數(shù)年）內(nèi)反復(fù)發(fā)作。這種慢性疼痛給患者的生活帶來極大的痛苦，大大地降低了患者的生活質(zhì)量。這種慢性、持續(xù)的疼痛是病人就醫(yī)的最常見的原因，因此，臨床上對(duì)慢性

2、疼痛的治療日益重視，然而，目前常用的治療疼痛的藥物或手段存在一定的缺陷[1-4]，如小劑量的阿片類藥物治療慢性疼痛的效果不佳，用量過大會(huì)導(dǎo)致惡心、嘔吐、呼吸抑制等副作用，長(zhǎng)期應(yīng)用還可能發(fā)生耐受。臨床上迫切需要新的更為有效的治療疼痛的藥物。
　　 慢性疼痛如神經(jīng)病理性疼痛是炎癥或神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的痛覺神經(jīng)細(xì)胞高反應(yīng)性的一種表現(xiàn)。外周傷害性刺激或組織損傷引起初級(jí)傳入神經(jīng)末梢釋放興奮性的氨基酸(EAAs)和其它一些神經(jīng)遞質(zhì)到脊髓后角。這

3、些興奮性氨基酸（EAA）如N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)可以通過其受體而介導(dǎo)脊髓后角及其它部位的突觸后興奮的傳遞。Yu和Salter等[3]發(fā)現(xiàn)NMDA受體上調(diào)可以引起細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高，導(dǎo)致突觸間興奮性傳遞增強(qiáng)，從而產(chǎn)生痛覺中樞敏感性增高。因此，通過阻斷NMDA受體而抑制NMDA的神經(jīng)興奮性遞質(zhì)作用，可以阻斷痛覺的中樞興奮性傳導(dǎo)，治療慢性疼痛。但是，目前的NMDA受體阻斷劑[5-6]如MK

4、-801和APV都有很強(qiáng)的毒副作用，不能在臨床上使用。所以Garry等[4]提出可以利用基因干擾NMDA受體基因來治療慢性疼痛。
　　 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制，指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異降解該mRNA，從而使特異性的基因有效封閉的過程，是一

5、種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)[7]。
　　 要將siRNA成功導(dǎo)入體內(nèi)，并能夠安全且又高效抑制基因的表達(dá)，合適有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)工具是關(guān)鍵，目前，病毒載體無疑是效率很高的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具，然而，因?yàn)榘踩脑?，病毒載體適合離體細(xì)胞，但不適合以治療為目的的在體細(xì)胞。最近，人們又尋找到了新的導(dǎo)入介質(zhì)-由低分子量PEI和膽固醇組成的水溶性脂聚體(water-solub

6、lelipopolymer，WSLP)，利用WSLP直接與siRNA連接，形成WSLP/siRNA復(fù)合物，將其導(dǎo)入離體和在體細(xì)胞，具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較小的的細(xì)胞毒性，而且沒有病毒載體的安全顧慮[8-9]。
　　 綜上所述，我們推測(cè):使用WSLP運(yùn)載NR1-siRNA,可以抑制脊髓NMDA受體的表達(dá)，最終達(dá)到治療疼痛的目的。本研究以NR1為靶點(diǎn)，先構(gòu)建NR1-siRNA，再制備新的基因運(yùn)載體WSLP，將WSLP直接與NR1-si

7、RNA寡核甘酸鏈連接以合成WSLP/siRNA，建立大鼠鞘內(nèi)置管模型，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和western-blot技術(shù)檢測(cè)鞘內(nèi)注射WSLP/siRNA后正常SD大鼠脊髓NR1表達(dá)的變化;然后建立神經(jīng)病理性痛大鼠模型，檢測(cè)鞘內(nèi)注射WSLP/siRNA后神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓NR1表達(dá)的變化及觀察大鼠行為學(xué)的變化，以探討WSLP/siRNA治療慢性疼痛的可行性，為疼痛的治療提供新思路、新方法。
　　 目的：
　　 證實(shí)

8、鞘內(nèi)注射WSLP/siRNA復(fù)合物沉默大鼠脊髓NR1表達(dá)，觀察鞘內(nèi)注射WSLP/siRNA復(fù)合物對(duì)神經(jīng)大鼠病理性痛的治療作用，為進(jìn)一步的觀察WSLP運(yùn)載siRNA治療慢性疼痛的可行性及其優(yōu)勢(shì)打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 研究過程分為四部分進(jìn)行。(1)合成WSLP/siRNA。①參照文獻(xiàn)合成WSLP;②參照文獻(xiàn)選取NR1-siRNA序列，由廣州銳博公司合成NR1-siRNA;③合成WSLP/siRNA，參照文獻(xiàn)以及前期研

9、究結(jié)果，將WSLP和siRNA按照質(zhì)量比為5:1混合后，室溫下靜置30min。(2)水溶性脂質(zhì)體運(yùn)載siRNA沉默大鼠脊髓NR1的可行性的實(shí)驗(yàn)研究。取鞘內(nèi)置管成功的成年SD大鼠18只，隨機(jī)均分為3組:NS組（鞘內(nèi)注射生理鹽水，n=6）、裸siRNA組（鞘內(nèi)注射裸siRNA，n=6）、WSLP/siRNA組（鞘內(nèi)注射WSLP/siRNA混合物，n=6），鞘內(nèi)注射容積均為10μl，其中siRNA的量為1nmol，制作鞘內(nèi)置管模型參照文獻(xiàn)進(jìn)行

10、。鞘內(nèi)注射第4天冰面上摘取L4-6節(jié)段脊髓，均分為兩份，存放液氮中。①取各組脊髓標(biāo)本，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)各組大鼠脊髓中NR1mRNA表達(dá)變化。②取各組脊髓標(biāo)本，采用western-blot的方法，檢測(cè)各組大鼠脊髓中NR1蛋白表達(dá)的變化。(3)水溶性脂質(zhì)體運(yùn)載NR1-siRNA對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓NR1表達(dá)的影響。參照文獻(xiàn)制作大鼠神經(jīng)病理性痛模型和鞘內(nèi)置管模型，將24只SD健康成年大鼠隨機(jī)分為4組:假手

11、術(shù)組(Sh組，n=6)、神經(jīng)病理性痛組(NS組，鞘內(nèi)注射生理鹽水，n=6)、神經(jīng)病理性痛治療組(WSLP組，鞘內(nèi)注射WSLP/siRNA混合物，n=6)及亂序siRNA治療神經(jīng)病理性痛組（sWSLP組，鞘內(nèi)注射亂序WSLP/scRNA混合物，n=6）。神經(jīng)病理性痛模型采用坐骨神經(jīng)分支選擇結(jié)扎切斷模型(SparednerveInjurymodel，SNI)。神經(jīng)病理性痛模型和鞘內(nèi)置管模型制作后第2天鞘內(nèi)分別注射鞘內(nèi)注射生理鹽水、WSLP/

12、siRNA混合物、WSLP/scRNA混合物。鞘內(nèi)注射第4天冰面上摘取L4-6節(jié)段脊髓，均分為兩份，存放液氮中。①取各組脊髓標(biāo)本，提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)各組大鼠脊髓中NR1mRNA表達(dá)變化。②取各組脊髓標(biāo)本，采用western-blot的方法，檢測(cè)各組大鼠脊髓中NR1蛋白表達(dá)的變化。(4)水溶性脂質(zhì)體運(yùn)載NR1-siRNA對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠痛行為學(xué)的影響。參照文獻(xiàn)制作大鼠神經(jīng)病理性痛模型和鞘內(nèi)置管模型，將24

13、只健康成年SD大鼠隨機(jī)均分為4組:S組(n=6)、C組(n=6)、W組(n=6)和L組(n=6)。S組只制作鞘內(nèi)置管模型和暴露坐骨神經(jīng);C組、W組和L組分別在神經(jīng)病理性痛模型和鞘內(nèi)置管模型制作后第2天鞘內(nèi)分別注射鞘內(nèi)注射生理鹽水、WSLP/siRNA混合物、WSLP/scRNA混合物。分別于造模前1天、造模后1天、造模后第3天、造模后第5天、造模后第7天觀察大鼠行為學(xué)變化，采用累積疼痛評(píng)分法來評(píng)估大鼠的神經(jīng)病理性疼痛。
　　 結(jié)

14、果：
　　 (1)水溶性脂質(zhì)體運(yùn)載siRNA沉默大鼠脊髓NR1可行性的實(shí)驗(yàn)研究。研究結(jié)果如下:①實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果NS組、裸siRNA組和WSLP/siRNA組三組大鼠脊髓NR1mRNA表達(dá)水平是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的(F=1116.629，P＜0.01);其中裸siRNA組與NS組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P=0.441)，WSLP/siRNA組較NS組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平下降(P＜0.01)。②Wes

15、tern-Blot檢測(cè)結(jié)果NS組、裸siRNA組和WSLP/siRNA組三組大鼠脊髓NR1蛋白表達(dá)水平是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的(F=155.358，P＜0.01);其中裸siRNA組與NS組比較脊髓NR1蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P=0.149);而WSLP/siRNA組較NS組脊髓NR1蛋白表達(dá)水平下降(P＜0.01)。
　　 (2)水溶性脂質(zhì)體運(yùn)載NR1-siRNA對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓NR1表達(dá)的影響。研究結(jié)果如下:①實(shí)時(shí)熒光定量R

16、T-PCR檢測(cè)結(jié)果四組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的(F=344.179，P＜0.01)。與S組比較，C組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，L組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平也顯著增強(qiáng)(P＜0.01);與C組比較，W組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，L組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平無明顯變化(P=0.201)。②Western-Blot檢測(cè)結(jié)果四組脊髓NR1mRNA表達(dá)水平是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的(F

17、=741.420，P＜0.01)。與S組比較，C組脊髓NR1蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)（P＜0.01）;L組脊髓NR1蛋白表達(dá)水平也顯著增強(qiáng)（P＜0.01）;與C組比較，W組脊髓蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），而L組脊髓蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P=0.596)。
　　 (3)水溶性脂質(zhì)體運(yùn)載NR1-siRNA對(duì)大鼠神經(jīng)病理性痛累積疼痛評(píng)分的影響。鞘內(nèi)注射WSLP/NR1-siRNA對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠累積疼痛評(píng)分的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

18、意義（F=458.347，P＜0.01）;手術(shù)前后時(shí)間對(duì)累積疼痛評(píng)分的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=749.112，P＜0.01);手術(shù)前后時(shí)間與鞘內(nèi)給藥之間有交互效應(yīng)(F=86.405，P＜0.001)。術(shù)后3天，四組大鼠累積疼痛評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=224.042，P＜0.01）;與術(shù)后3天C組比較，術(shù)后3天W組累積疼痛評(píng)分降低（P＜0.01），而術(shù)后3天L組累積疼痛評(píng)分無明顯變化(P=0.370)。
　　 結(jié)論：