大劑量甲基強的松龍對大鼠脊髓損傷后MMP-9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：本實驗通過研究SCI后MMP-9表達(dá)和細(xì)胞凋亡規(guī)律，以及MMP-9表達(dá)與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，探討MMP-9在SCI后繼發(fā)性細(xì)胞凋亡中的作用，為繼發(fā)性脊髓損傷的治療提供新的思路。并探討甲基強的松龍對SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其作用機理，為甲基強的松龍治療脊髓損傷提供新的理論依據(jù)。 方法：成年雄性SD大鼠126只，隨機分為三組：假手術(shù)組(sham operation group，SO group)、單純損傷組(Spinal c

2、ordinjury group，SCI group)和MP治療組(MP treatment group，MPgroup)。10％水合氯醛麻醉后，假手術(shù)組42只，僅做T9-10節(jié)段椎板切除術(shù)；單純損傷組42只，暴露T9-10節(jié)段脊髓，按改良Allen’s法，將10g條形重物通過導(dǎo)管，從5cm高度垂直落下打擊該段脊髓背側(cè)正中制作SCI模型。MP治療組42只，用同樣的打擊方法損傷脊髓T9-10節(jié)段，并于術(shù)后30min從大鼠尾靜脈內(nèi)靜注大劑量甲

3、基強的松龍(Methylprednisolone，MP)(30mg/kg)。三組大鼠均于SCI后1h、6h、12h、1d、3d、5d、7d(每個時間點n=6)處死大鼠取材。采用蘇木精-伊紅染色(HE)觀察損傷脊髓組織病理改變，免疫組織化學(xué)染色觀察損傷脊髓組織MMP-9表達(dá)并測平均光密度值(Optical density，OD)，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)觀察損傷脊髓組織細(xì)胞凋亡并計算凋亡指數(shù)(Apoptotic Index，AI

4、)。分別對各時間點損傷脊髓組織MMP-9平均光密度和細(xì)胞凋亡指數(shù)進(jìn)行組間、組內(nèi)比較，并對單純損傷組各時間點MMP-9平均光密度和細(xì)胞凋亡指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果：①免疫組織化學(xué)染色顯示：假手術(shù)組各時間點均未見MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)。單純損傷組SCI后1h，損傷段脊髓可見MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)，6h表達(dá)增高，1d達(dá)高峰(MMP-9平均光密度0.310±0.019)，維持到3d(MMP-9平均光密度0.261±0.024)，然后開

5、始減少，7d仍有表達(dá)，陽性細(xì)胞主要表達(dá)在缺血神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，灰質(zhì)和白質(zhì)均有表達(dá)。假手術(shù)組和單純損傷組各時間點MMP-9平均光密度值比較有顯著差異(p＜0.05)。單純損傷組SCI后各時間點MMP-9平均光密度值比較顯示，1d與其余各時間點比較均有顯著性差異(p＜0.05)，6h與7d比較無差異(p＞0.05)。MP治療組SCI后各相應(yīng)時間點MMP-9表達(dá)的強度較損傷組明顯下降，仍是6h表達(dá)增高，1d達(dá)高峰并維持(MMP

6、-9平均光密度值0.254±0.043)，5d開始減少，7d仍有少量表達(dá)。MP治療組和損傷組各時間點MMP-9平均光密度值比較有顯著差異(p＜0.05)。治療組SCI后各時間點MMP-9平均光密度值比較顯示，1d與其余各時間點比較均有顯著性差異(p＜0.05)。②TUNEL法標(biāo)記結(jié)果顯示：假手術(shù)組各時間點均未見TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞。單純損傷組TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞1h開始出現(xiàn)，6h逐漸增加，1d達(dá)高峰(平均凋亡指數(shù)31.176±3.0

7、91)，5d表達(dá)減少，7d仍有表達(dá)。陽性細(xì)胞主要見于灰質(zhì)的神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)。單純損傷組和假手術(shù)組各時間點凋亡指數(shù)比較有顯著差異(p＜0.05)。單純損傷組SCI后各時間點凋亡指數(shù)比較顯示，1d與其余各時間點比較均有顯著性差異(p＜0.05)，5d與12h比較無差異(p＞0.05)。MP治療組SCI后各相應(yīng)時間點TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)較損傷組明顯減少，仍是6h表達(dá)增高，1d達(dá)高峰并維持(平均凋亡指數(shù)21.928±2.14

8、1)，5d開始減少，7d仍有少量表達(dá)。MP治療組和單純損傷組各時間點凋亡指數(shù)比較有顯著差異(p＜0.05)。MP治療組SCI后各時間點凋亡指數(shù)比較顯示，1d與其余各時間點比較均有顯著性差異(p＜0.05)，5d與12h比較無差異(p＞0.05)，7d與6h比較無差異(p＞0.05)。③單純損傷組各時間點MMP-9平均光密度值與凋亡指數(shù)做相關(guān)性分析得出結(jié)論：MMP-9的表達(dá)量和細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化呈正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r=0.936，P＜0

9、.05)。 結(jié)論：①大鼠SCI后損傷節(jié)段脊髓組織中MMP-9表達(dá)明顯增多，24h達(dá)高峰，持續(xù)至3d后逐漸下降，7d仍有表達(dá)，實驗結(jié)果說明SCI后MMP-9表達(dá)與繼發(fā)性脊髓損傷的病理發(fā)展過程有關(guān)。②大鼠SCI后損傷節(jié)段脊髓組織存在繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)逐漸增高，24h達(dá)高峰，持續(xù)至3d后下降，7d仍可見陽性凋亡細(xì)胞。實驗結(jié)果表明SCI后存在著繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重了原發(fā)性脊髓損傷。③SCI后損傷節(jié)段脊髓組織的MMP-