貝伐單抗對大鼠結(jié)膜成纖維細胞生長及濾過術(shù)后瘢痕化的影響.pdf

1、[目的]：
　　 1、檢測S-D大鼠結(jié)膜成纖維細胞中血管內(nèi)皮生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)及其受體，以及炎癥因子的mRNA表達情況。
　　 2、研究貝伐單抗（anti-VEGFA,Avastin）對大鼠結(jié)膜成纖維細胞生長曲線的影響，以及對結(jié)膜成纖維細胞中血管內(nèi)皮生長因子、炎癥因子表達的影響。
　　 3、評價貝伐單抗對大鼠濾過泡形態(tài)學(xué)影響以及濾過泡內(nèi)血管內(nèi)皮生長

2、因子、炎癥因子的影響。
　　 [方法]：
　　 1．結(jié)膜成纖維細胞(Fibroblasts，F(xiàn)Bs)培養(yǎng)及鑒定：以5只出生后4周的S-D大鼠為實驗對象，剪取結(jié)膜下組織，應(yīng)用組織塊法接種于培養(yǎng)基并培養(yǎng)。觀察FBs生長。傳代至第5代后，將培養(yǎng)的S-D大鼠的FBs分別接種于96孔板，分別在24小時、48小時、72小時、120小時、7天、14天共六個時點，用MTT法測量細胞密度并繪制S-D大鼠FBs的正常生長曲線。取對數(shù)生長期的

3、培養(yǎng)的第四和第五代FBs，以間接免疫熒光法鑒定。陽性對照為波形蛋白熒光染色(Vimentin-FITC)，陰性對照為角蛋白熒光染色(Keratin-FITC)。
　　 2．FBs中生長因子和受體的表達：取第四代和第五代培養(yǎng)的S-D大鼠的FBs，以間接免疫熒光法鑒定VEGFR1的熒光表達。根據(jù)Primerblast程序及參考文獻設(shè)計VEGF164，VEGFR1(Flt-1)，VEGFR2(Flk1)，TGFβ1和TGFβ2五種基因

4、的RNA引物序列。以Trizol法提取FBs中的mRNA，在RNA反轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成cDNA，以25μl體系行PCR擴增。配制2％瓊脂糖凝膠并跑膠。對目的條帶切膠純化后進行基因測序。測序結(jié)果進行NCBIPrimerBlast比對，以驗證擴增的片斷是否屬于目的基因序列。
　　 3．貝伐單抗對培養(yǎng)的結(jié)膜FBs生長的影響：以離體培養(yǎng)的大鼠第五代結(jié)膜FBs為對象，在96孔板中加入不同濃度的貝伐單抗干預(yù)FBs生長。貝伐單抗的終濃度分別為

5、12.5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.5mg/ml、0.05mg/ml、0.005mg/ml，并設(shè)置5個復(fù)孔。觀察時點為第1天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天。分別以MTT法檢測FBs生長狀況，繪制不同濃度貝伐單抗干預(yù)下FBs的生長曲線。以2.5mg/ml（最適干預(yù)濃度）的貝伐單抗干預(yù)6孔板培養(yǎng)的第六代FBs細胞，提取培養(yǎng)48小時FBs細胞的mRNA。通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用ABI7500熒光定量PC

6、R反應(yīng)儀進行PCR擴增及檢測，繪制標準曲線對擴增效率進行檢驗及熔解曲線對擴增特異性進行檢驗。對VEGF164，VEGFR1(Flt-1)，VEGFR2(Flk1)，TGFβ1，TGFβ2行熒光定量PCR檢測，根據(jù)擴增曲線及ddCt值進行統(tǒng)計，檢測五種基因的mRNA表達豐度變化。
　　 4．貝伐單抗對大鼠眼外濾過術(shù)后濾過泡形態(tài)的影響：以55只出生后4周的S-D大鼠為實驗對象，進行分組。5只大鼠的單眼用于眼外濾過手術(shù)模型的建立。干預(yù)

7、研究分為A1組、A2組和B組。A1組（貝伐單抗干預(yù)組）：共25只眼(25只大鼠)，在每個時間點（共5個時點），選5只大鼠的一只眼行眼外濾過聯(lián)合貝伐單抗結(jié)膜下注射（5眼/時點×5個時點）；A2組（另眼對照組）：共25只眼（與A1組為同一組大鼠），在與A1組相同的每個時間點，選5只大鼠的另只眼行濾過手術(shù)聯(lián)合PBS結(jié)膜下注射（5眼/時點×5個時點）；B組（單獨對照組）：共25只眼（25只大鼠），在與A1組相同的每個時間點，選5只大鼠的一只眼行

8、濾過手術(shù)聯(lián)合PBS結(jié)膜下注射（5眼/時點×5個時點）。首先對5只大鼠進行眼外濾過手術(shù)，以上方角膜緣為基底，制作大鼠眼外濾過手術(shù)模型并建立標準化手術(shù)步驟。連續(xù)觀察術(shù)后濾過泡形態(tài)及前節(jié)變化至第14天，記錄形態(tài)學(xué)改變及不良事件。對50只大鼠施行眼外濾過聯(lián)合結(jié)膜下注藥術(shù)。干預(yù)方法為盲法隨機注射貝伐單抗或PBS緩沖液3μl于下方穹隆結(jié)膜。觀察時點為第1天、第2天、第3天、第5天、第8天（根據(jù)細胞生長曲線及濾過泡術(shù)后形態(tài)變化設(shè)定）。觀察項目為：濾過

9、泡形態(tài)（0～3級）；濾過泡充血（0～3級）；不良事件，包括前房出血(0～3級)、虹膜變化（0～3級）和其它不良反應(yīng)。根據(jù)觀察記錄進行Kruskal-WallisH檢驗；進一步進行兩兩比較：采用秩變換，以秩次代替原變量進行方差參數(shù)分析。
　　 5．貝伐單抗對大鼠濾過泡中生長因子和受體表達的影響：選擇在第五部分接受眼外濾過聯(lián)合結(jié)膜下注藥術(shù)的三組S-D大鼠。分別在第1天、第2天、第3天、第5天、第8天五個時間點將實驗動物處死剪取濾過泡

10、組織，并即刻液氮冷凍保存。在統(tǒng)一時間以Trizol法提取mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)ABI7500熒光定量PCR檢測。檢測目的基因包括：VEGF164，VEGFR1(Flt-1)，VEGFR2(Flk1)、TGFβ1、TGFβ2及內(nèi)參照β-actin。結(jié)果采用One-WayANOVA檢驗，比較在不同時間點，三組樣本中各基因的RNA表達差異。各時點采集的濾過泡標本以Trizol法提取mRNA的同時提取組織總蛋白，采用Western-b

11、lotting法檢測在不同時間點的三組樣本中，VEGFA、TGFB1和TGFβ2蛋白表達情況的差異。
　　 [結(jié)果]：
　　 1．體外培養(yǎng)S-D大鼠結(jié)膜FBs的形態(tài)學(xué)特征和生長曲線：S-D大鼠的結(jié)膜囊組織塊在接種6小時內(nèi)大部分貼壁。第3天可見FBs自組織塊邊緣長出，經(jīng)1∶1傳代后，約7天可達80%融合。大鼠結(jié)膜組織培養(yǎng)后的FBs細胞較短，可見分枝狀、多角形及不規(guī)則形細胞。MTT法檢測顯示，F(xiàn)Bs的對數(shù)生長期為第2～7天，

12、第8天后進入平臺期。
　　 2．培養(yǎng)大鼠結(jié)膜FBs的免疫熒光鑒定結(jié)果：間接免疫熒光法染色可見S-D大鼠結(jié)膜FBs波形蛋白熒光染色陽性，角蛋白熒光染色陰性。
　　 3．培養(yǎng)大鼠結(jié)膜FBs中生長因子和受體的表達：間接免疫熒光法染色見細胞膜上VEGFR1呈弱陽性表達。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物測序結(jié)果均符合目的基因序列(VEGF164、Flt-1、Flk1、TGFβ1和TGFβ2)。引物經(jīng)擴增曲線檢驗，證實擴增效率一致。
　　 4．貝

13、伐單抗對培養(yǎng)結(jié)膜FBs生長曲線影響：對處于對數(shù)生長期的FBs按照不同濃度梯度進行貝伐單抗干預(yù)后顯示，終濃度為2.5mg/ml的貝伐單抗對FBs生長具有更顯著的抑制作用。終濃度為12.5mg/ml的貝伐單抗干預(yù)后，F(xiàn)Bs在24小時內(nèi)死亡。
　　 5．貝伐單抗(2.5mg/ml)干預(yù)培養(yǎng)結(jié)膜FBs的熒光定量PCR結(jié)果：(1)對數(shù)生長期的大鼠結(jié)膜FBs中，VEGF164、VEGFR1、VEGFR2、TGFβ2mRNA表達均顯著增加，而

14、TGFβ1mRNA表達變化不明顯且不受貝伐單抗影響。(2)2.5mg/ml貝伐單抗干預(yù)后48小時，各細胞因子的mRNA表達豐度均較對照組顯著降低，其中以VEGF164(45%)和TGFβ2(25%)抑制更為顯著。
　　 6．S-D大鼠眼外濾過術(shù)后的濾過泡形態(tài)：接受濾過手術(shù)后，濾過泡在術(shù)后4天內(nèi)保持彌散隆起形態(tài)，第6天濾過泡開始平伏。
　　 7．濾過術(shù)聯(lián)合貝伐單抗結(jié)膜下注射后對濾過泡的影響及不良事件：貝伐單抗干預(yù)組（A1組

15、）出現(xiàn)濾過泡平伏的例數(shù)為0例（發(fā)生例數(shù)少于兩對照組）,3級濾過泡例數(shù)多于兩對照組，經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗顯示三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.032)；A1組濾過泡充血少于兩對照組(p=0.003)。不良事件中，A1組前房出血少于兩對照組(p=0.002);A1組虹膜反應(yīng)輕于兩對照組(p=0.000)。
　　 8．經(jīng)貝伐單抗干預(yù)后濾過泡內(nèi)生長因子和受體的mRNA表達變化：貝伐單抗干預(yù)組（A1組）的濾過泡中，VEGF1

16、64.Flt-1、Flk1、TGFβ1和TGFβ2mRNA表達水平均較兩對照組顯著下調(diào)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；單眼濾過手術(shù)聯(lián)合PBS注射后（B組）的VEGF164mRNA在第1天增加，第2～5天達到峰值。A1組的VEGF164mRNA水平穩(wěn)定維持在較低水平；Flt-1mRNA表達豐度延時增高；TGFβ1mRNA在對數(shù)生長期（3～5天）表達豐度較其它組顯著降低；TGFβ2mRNA在各時點的表達豐度較其它組顯著降低。TGFβ

17、2mRNA整體表達豐度在上述基因中最高，且表達波動最大。
　　 9．經(jīng)貝伐單抗干預(yù)后濾過泡內(nèi)生長因子和受體的蛋白表達變化：在多個時點，貝伐單抗干預(yù)組（A1組）的VEGF-A蛋白(44KD)、TGFβ1蛋白(25KD)、TGFβ2蛋白(48KD)的條帶濃度均低于兩對照組。
　　 [結(jié)論]：
　　 1．S-D大鼠結(jié)膜成纖維細胞存在VEGF及其受體(VEGFR1、VEGFR2)的表達以及炎癥因子(TGFβ1、TGFβ2