LKB1-AMPK信號通路相關(guān)基因在家兔腸炎模型中的表達(dá)差異研究.pdf

1、LKB1/AMPK信號通路廣泛參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理活動，調(diào)控能量代謝等生命活動。而LKB1基因作為AMPK上游關(guān)鍵基因之一，其突變或者失活會引起AMPK信號通路變化，由此導(dǎo)致人類胃腸道疾病發(fā)生。因此，本試驗(yàn)旨在研究LKB1/AMPK信號通路內(nèi)信號因子在家兔非特異性腸炎中的表達(dá)差異和作用機(jī)制，從而為家兔非特異性腸炎治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。試驗(yàn)前期克隆LKB1基因并通過構(gòu)建低纖維日糧誘導(dǎo)家兔非特異性腸炎模型，采用RT-qPC

2、R法檢測LKB1、AMPK(PRKAA2)、mTOR和NF-κβ基因在健康正常組（30只）和低纖維誘導(dǎo)腸炎組（60只）中7個組織（十二指腸、圓小囊、空腸、回腸、結(jié)腸、肝臟和脾臟）的mRNA表達(dá)量。試驗(yàn)后期通過培養(yǎng)家兔結(jié)腸上皮細(xì)胞(CEC)以及利用LPS構(gòu)建家兔CEC炎癥模型，采用RNAi技術(shù)干擾炎癥細(xì)胞中LKB1基因的表達(dá)，然后通過RT-qPCR法檢測LKB1、PRKAA2、NUAK1、mTOR、NF-κβ、IL-1A、TNF-α、PG

3、C-1α和ATG13基因在不同炎癥細(xì)胞組中mRNA表達(dá)量，由此分析LKB1/AMPK信號通路在家兔非特異性腸炎中的作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1、克隆得到家兔LKB1基因的CDS全序列（GenBank登錄號為KT439400）。CDS區(qū)全長分別為1317 bp，編碼氨基酸數(shù)為438。家兔LKB1基因核苷酸序列與人、鼠兔和溝鼠同源基因序列一致性分別為87.85％、89.98％和85.42％，表明LKB1基因在物種間進(jìn)化高度保守。<

4、br>　　2、檢測LKB1、AMPK、mTOR和NF-κβ基因在家兔低纖維日糧誘導(dǎo)非特異性腸炎模型中7個不同組織樣本中的表達(dá)差異，結(jié)果表明在腸炎組的肝臟組織中LKB1表達(dá)量升高，其中mTOR基因表達(dá)量極顯著升高，并與炎癥因子NF-κβ呈負(fù)相關(guān)。在腸炎組的小腸的三個組織中LKB1、PRKAA2、NF-κβ與mTOR呈負(fù)相關(guān)，其中在十二指腸中LKB1基因表達(dá)與NF-κβ表達(dá)呈正相關(guān)，mTOR極顯著升高，并與NF-κβ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。而在腸炎組

5、免疫組織（圓小囊和脾臟）中LKB1、PRKAA2、mTOR均與炎癥因子NF-κβ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　3、復(fù)蘇和培養(yǎng)已分離純化的CEC細(xì)胞后，當(dāng)添加LPS終濃度為1000ng/ml時，成功構(gòu)建了家兔結(jié)腸炎癥細(xì)胞(CEC)炎癥模型。
　　4、利用RNAi技術(shù)干擾炎癥CEC中LKB1基因的表達(dá)，成功篩選出能夠沉默LKB1基因表達(dá)的si-02-LKB1，沉默效率達(dá)90.7％。
　　5、檢測炎癥細(xì)胞組模型（轉(zhuǎn)染si-02-LKB

6、1炎癥細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染siRNA炎癥細(xì)胞組）中LKB1/AMPK信號通路相關(guān)信號因子的表達(dá)差異，結(jié)果表明干擾LKB1基因表達(dá)后，引起AMPK信號通路下游基因AMPK(PRKAA2)、mTOR、PGC-1α和ATG13表達(dá)量在不同時段升高，而AMPK(NUAK1)、IL-1A和TNF-α下降。由此表明LKB1基因通過AMPK信號通路相關(guān)信號因子影響炎癥因子表達(dá)。
　　本試驗(yàn)通過克隆家兔LKB1基因和研究LKB1/AMPK信號通路下游基