急性波動(dòng)性高血糖對(duì)活體大鼠胰島素敏感性影響的研究.pdf

1、糖尿病是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的代謝性疾病,由于胰島素分泌缺乏和(或)其生物作用障礙導(dǎo)致的糖代謝紊亂,同時(shí)伴有脂肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)等的代謝障礙,以慢性高血糖為主要特征。慢性高血糖常導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)和心血管等多臟器的長(zhǎng)期損害、功能不全或衰竭。業(yè)已證實(shí)氧化應(yīng)激是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一,活性氧(ROS)在糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制中的之一主要是其對(duì)組織和細(xì)胞的細(xì)胞毒性損傷,ROS包括超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫、一氧

2、化氮(NO)等。NO可迅速和超氧化物結(jié)合形成更強(qiáng)的氧化劑——過(guò)氧化亞硝酸鹽(ONOO-)。ONOO-可通過(guò)影響細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和離子通道、使蛋白質(zhì)發(fā)生硝基化或失活,進(jìn)而限制線粒體呼吸,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 近年來(lái)研究表明:糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展不僅與血糖整體水平升高有關(guān),而且與血糖的波動(dòng)性也有密切關(guān)系,血糖波動(dòng)性越高,慢性并發(fā)癥的危險(xiǎn)性越大。國(guó)外曾進(jìn)行過(guò)一項(xiàng)試驗(yàn),觀察“正常血糖和高血糖交替”對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響,

3、結(jié)果發(fā)現(xiàn),“波動(dòng)性高血糖組”對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷比“穩(wěn)定性高血糖組”更加嚴(yán)重。該項(xiàng)研究提示:波動(dòng)性高血糖更能增強(qiáng)蛋白激酶C(PKC)活性,激活氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[1],并最終加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。臨床研究也正實(shí):波動(dòng)性高血糖可顯著增加2型糖尿病的微血管病變和心血管死亡危險(xiǎn)[2]。反復(fù)波動(dòng)的高糖環(huán)境下市,由于適應(yīng)能力欠缺,加速了細(xì)胞形態(tài)和功能的損害[3]。DCCT和UKPDS試驗(yàn)的大量循證醫(yī)學(xué)研究證實(shí)嚴(yán)格控制血糖(即“強(qiáng)化治療”

4、)可以顯著減少糖尿病的并發(fā)癥,尤其是微血管并發(fā)癥。同時(shí)也必須看到,血糖控制越嚴(yán)格,低血糖事件的發(fā)生率越高[4,5],血糖波動(dòng)的幅度越大,前者的益處在一定程度上被后者所抵消。為此,國(guó)際上提出了“精細(xì)降糖,平穩(wěn)達(dá)標(biāo)”這一新的治療理念,簡(jiǎn)單的說(shuō),就是“既要降低高血糖,又要防止低血糖?！?br>　　 目的：
　　 因此,近年來(lái)國(guó)際上對(duì)血糖波動(dòng)的研究正在逐漸得到重視。目前國(guó)際上關(guān)于血糖波動(dòng)的研究多集中于血糖波動(dòng)對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響,是體

5、外研究。而且目前的研究主要局限在血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病并發(fā)癥的影響,對(duì)于血糖波動(dòng)對(duì)正常機(jī)體的影響有何影響;對(duì)正常機(jī)體胰島細(xì)胞及胰島素靶細(xì)胞敏感性等這些關(guān)于糖尿病發(fā)生機(jī)制的方面研究較少,特別是因?yàn)橛捎诩毙匝遣▌?dòng)動(dòng)物模型建立的困難,所以針對(duì)急性血糖波動(dòng)對(duì)機(jī)體影響的的研究,尚未見報(bào)道。本研究擬采用高濃度葡萄糖輸注的方法建立活體急性血糖波動(dòng)大鼠動(dòng)物模型,以組織病理學(xué)、免疫印記技術(shù)、RT-PCR等不同的檢測(cè)方法對(duì)血糖波動(dòng)大鼠肝臟、脂肪、肌肉及胰腺等器

6、官進(jìn)行檢測(cè),探討體內(nèi)血糖波動(dòng)對(duì)活體大鼠機(jī)體的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)材料及方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 選取7周健康雄性Wistar大鼠30只,體重280g-350g,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,清潔度Ⅰ級(jí),隨機(jī)被分為3組,分別為對(duì)照組、血糖波動(dòng)組、持續(xù)高血糖組,常規(guī)飼料自由飲水,溫度22±1℃,濕度50％左右,明/暗周期為12h。
　　 二、建立持續(xù)高血糖、波動(dòng)性高血糖大鼠動(dòng)物模型
　　 大鼠

7、適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境3-5天后,用10％水合氯醛(按體重0.35mg/kg)腹腔麻醉,將聚乙烯導(dǎo)管2根,分別植入右頸內(nèi)靜脈用于輸液和左頸動(dòng)脈用于采血。大鼠術(shù)后恢復(fù)5天,進(jìn)行輸液。干預(yù)因素:①對(duì)照組予0.9％生理鹽水,定時(shí)檢測(cè)血糖使血糖維持在5.5±0.5mmol/L左右,在實(shí)驗(yàn)第44小時(shí)后進(jìn)行正葡萄糖-高胰島素鉗央實(shí)驗(yàn),將血糖升至20.0±0.5mmol/L,維持半小時(shí);②血糖波動(dòng)組予50％葡萄糖注射液?jiǎn)枖噍斪?每小時(shí)檢測(cè)血糖一次,使血糖在5

8、±0.5mmol/L與20±0.5mmol/L之間波動(dòng),每1小時(shí)變動(dòng)血糖值一次(即血糖控制在5mmol/L持續(xù)1小時(shí),然后血糖控制在20mmol/L持續(xù)1小時(shí));③持續(xù)高血糖組予50％葡萄糖注射液持續(xù)輸注,每小時(shí)檢測(cè)血糖一次,使血糖維持在20±0.5mmol/L左右。所有實(shí)驗(yàn)大鼠輸液時(shí)間在48小時(shí)。輸注相應(yīng)液體48小時(shí)后,動(dòng)物稱重,10％水合氯醛按0.3ml/100g腹腔注射麻醉動(dòng)物,固定于解剖臺(tái),剪去胸腹部毛發(fā),迅速開胸腹腔,心內(nèi)取血

9、5ml,3000轉(zhuǎn)/分離心15分,取上清于-70℃保存?zhèn)溆?。摘取肝臟左葉、腋下脂肪及腓腸肌標(biāo)本,速凍-70℃保存。
　　 三、主要實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、血清胰島素測(cè)定:酶聯(lián)免疫法;
　　 2、血清及組織勻漿MDA、SOD測(cè)定:比色法;
　　 3、血糖測(cè)定:采用葡萄糖氧化酶法(BIOSEN5030,德國(guó));
　　 4、大鼠肝細(xì)胞凋亡、胰腺細(xì)胞凋亡測(cè)定:應(yīng)用TUNNEL法;
　　 5、大鼠肝臟、

10、肌肉、脂肪TNFα mRNA表達(dá)測(cè)定:應(yīng)用RT-PCR法;
　　 6、大鼠肝臟、肌肉、脂肪內(nèi)JNK1、iNOS表達(dá)測(cè)定:應(yīng)用免疫組織化學(xué);
　　 7、大鼠肝臟、肌肉及脂肪內(nèi)IRS的表達(dá):Western Blot方法;
　　 8、大鼠胰腺組織caspaso-3、Bcl-2、Bax;肝臟內(nèi)caspas-3的表達(dá)測(cè)定:應(yīng)用免疫印跡法。
　　 結(jié)果：
　　 1、各組大鼠體重及空腹血糖:各組大鼠體重(P＞0

11、.05)及空腹血糖(P＞0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　 2、血糖波動(dòng)組大鼠血清MDA/SOD比值升高,顯著高于持續(xù)性高血糖組及對(duì)照組(P＜0.01);
　　 3、血糖波動(dòng)組大鼠的葡萄糖輸注率及血清胰島素2h后升高,14h達(dá)到高峰后開始下降,46h時(shí)仍高于對(duì)照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.01),48h與持續(xù)性高血糖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;48h血清胰島素與胰腺組織MDA/SOD比值呈顯著的負(fù)相關(guān)(P＜0.01):
　　 4、

12、46h血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組胰島素敏感指數(shù)顯著低于于對(duì)照組(P＜0.05),而血糖波動(dòng)組低于持續(xù)性高血糖組(P＜0.05);
　　 5、血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組大鼠胰腺組織內(nèi)MDA/SOD表達(dá)明顯增加,顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);血糖波動(dòng)組大鼠肝臟、脂肪及骨骼肌中MDA/SOD表達(dá)明顯增加,顯著高于對(duì)照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而且以在胰腺、肝臟組織表達(dá)最顯著(P＜0.01)

13、:
　　 6、血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組大鼠胰腺組織內(nèi)cleavage caspase-3、caspase-3表達(dá)明顯增加,cleavage caspase-3/caspase比值顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),持續(xù)性高血糖組的cleavage caspase-3/caspase比值顯著高于血糖波動(dòng)組(P＜0.05);胰腺組織MDA/SOD比值與cleavage caspase-3/caspase-3比值呈強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系(P＜

14、0.01),血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組胰腺組織B細(xì)胞凋亡增加(P＜0.05),但兩者之間無(wú)差異;
　　 7、血糖波動(dòng)組可見凋亡肝細(xì)胞,肝細(xì)胞凋亡表達(dá)顯著高于對(duì)照組和持續(xù)性高血糖組(P＜0.01);對(duì)照組和持續(xù)性高血糖組未見凋亡的肝細(xì)胞,兩組肝細(xì)胞凋亡表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P＞0.05);大鼠肝細(xì)胞caspase-3:血糖波動(dòng)組肝細(xì)胞內(nèi)caspase-3及cleavage oaspase-3表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)

15、及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05)。
　　 8、血糖波動(dòng)組大鼠肝臟、脂肪及骨骼肌中JNK1、iNOS表達(dá)明顯增加,顯著高于對(duì)照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而且以在肝臟組織表達(dá)最顯著(P＜0.01);MDA/SOD比值與JNK1、iNOS呈顯著強(qiáng)烈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01):
　　 9、血糖波動(dòng)組大鼠肝臟、脂肪TNFα mRNA表達(dá)明顯增加,顯著高于對(duì)照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而且以在肝臟組織表達(dá)最顯著(

16、P＜0.01);三組骨骼肌組織中TNFα mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　 10、血糖波動(dòng)組大鼠肝臟及脂肪組織中IRS-1的表達(dá)顯著下降,顯著低于對(duì)照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而三組骨骼肌組織中IRS-1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);肝臟組織內(nèi)IRS-1的表達(dá)與SI呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01);
　　 結(jié)論：
　　 1、通過(guò)輸注高濃度葡萄糖注射液,可以建立活體急性波動(dòng)性高血糖雄性Wi

17、star大鼠動(dòng)物模型;
　　 2、急性波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)雄性Wistar大鼠體內(nèi)ROS產(chǎn)生增多,氧化應(yīng)激水平增強(qiáng),導(dǎo)致胰島素分泌水平及胰島素敏感性下降,機(jī)體出現(xiàn)胰島功能障礙及胰島素抵抗;
　　 3、急性波動(dòng)性高血糖導(dǎo)致雄性Wistar大鼠胰腺、肝臟、脂肪及骨骼肌組織中ROS產(chǎn)生增加,其中對(duì)胰腺及肝臟組織的影響最為嚴(yán)重,并導(dǎo)致caspase-3激活,導(dǎo)致肝細(xì)胞及胰島β細(xì)胞凋亡增加;
　　 4、急性波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)大鼠

18、肝細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生顯著增加導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡顯著增加的主要病理生理機(jī)制是急性血糖波動(dòng)導(dǎo)致iNOS表達(dá)顯著增加,進(jìn)而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生顯著增加,后者促進(jìn)TNFα表達(dá)顯著增加:TNFα激活I(lǐng)NK1細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,使肝細(xì)胞內(nèi)caspase-3激活,導(dǎo)致急性血糖波動(dòng)組大鼠體內(nèi)肝細(xì)胞的凋亡顯著增加。
　　 5、急性波動(dòng)性高血糖時(shí),大鼠體內(nèi)肝臟及脂肪組織中IRS-1表達(dá)顯著較少,可能是急性波動(dòng)性高血糖導(dǎo)致活體大鼠體內(nèi)胰島素敏感性顯著降低的主要病理