白細胞介素—1β和皮質醇誘導人胎兒肺和羊絨成纖維細胞11β-HSD1表達的分子機制.pdf

1、胎兒器官成熟特別是肺成熟與分娩發(fā)動是一個協(xié)同進行的過程,而這一過程依賴于妊娠晚期內源性糖皮質激素的增加。由于人類胎兒腎上腺的特殊結構和胎盤糖皮質激素屏障的存在,妊娠晚期胎兒組織11β-羥基類固醇脫氫酶I型(11β-Hydroxysteroiddehydrogenasetype1,11β-HSDl)對17-羥-11-脫氫皮質酮的活化作用可能成為胎兒體內糖皮質激素的重要來源。目前已有充分證據(jù)表明,大多數(shù)動物胎兒肺能夠表達11β-HSD1,而

2、且11β-HSDl。小鼠肺成熟出現(xiàn)障礙,提示11β-HSDl在胎兒肺成熟中的關鍵作用,但人胎兒組織特別是肺是否表達-11β-HSDl目前還不明了。以往研究發(fā)現(xiàn),人胎膜表達的11β-HSD1也為胎兒器官成熟提供重要的糖皮質激素來源,糖皮質激素和促炎性細胞因子作為抑炎和促炎的兩種因子卻都可以誘導胎膜11βHSDl的表達,但其分子機制目前尚未闡明。本課題采用免疫組織化學、常規(guī)PCR、Westernblotting、實時熒光定量PCR、酶活性測

3、定、啟動子克隆與活性測定、功能蛋白過表達、染色質免疫沉淀(ChIP)和凝膠電泳遷移實驗(EMSA)等技術,首先研究了人胎兒肺組織是否表達11β-HSDl,然后分別以人胎兒肺成纖維細胞株(HFL-1)和原代培養(yǎng)人羊膜成纖維細胞為研究模型,研究了促炎性細胞因子(白細胞介素-1β)和糖皮質激素(皮質醇)誘導11β-HSDl表達的分子機制。
　　主要研究結果
　　1.常規(guī)PCR和免疫組織化學染色結果表明,妊娠中期(孕4個月)和晚期(

4、孕8個月)人胎肺組織中都能夠檢測到11β-HSD1Mrna,但只在妊娠晚期胎肺組織中檢測到11β-HSDl的分布,包括小支氣管和細支氣管的上皮細胞和小支氣管間質細胞。此外,在HFL-1細胞中也檢測到了11β-HSD1mRNA和蛋白,而且用Westernblotting和酶活性測定的方法證實了上述結果。此結果不但提示胎兒肺組織至少在妊娠晚期可以表達11β-HSD1蛋白,而且也提示HFL-1細胞是進一步研究胎兒肺11β-HSD1表達調控的良

5、好實驗模型。2.以HFL-1細胞和原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細胞為研究模型,用實時熒光定量PCR、Westernblotting和酶活性測定等方法研究發(fā)現(xiàn),白細胞介素-1β與皮質醇增加11βHSD1Mrna和蛋白水平的現(xiàn)象同時存在于HFL-1細胞和原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細胞中。
　　3.實時熒光定量PCR測定結果表明,白細胞介素-1β與皮質醇對人羊膜成纖維細胞和HFL-1細胞11β-HSD1Mrna表達的誘導作用能夠被Mrna轉錄抑制

6、劑DRB和蛋白質合成抑制劑CHX阻斷,提示白細胞介素-1β與皮質醇增加11β-HSD1mRNA水平的作用發(fā)生在轉錄水平并需要蛋白質合成的參與。用表達拮抗C／EBP蛋白的質粒(CMV-500-A-C／EBP)轉染HFL-1細胞和人羊膜成纖維細胞發(fā)現(xiàn),白細胞介素-1β與皮質醇誘導11β-HSDlMrna表達作用均可以被不同程度阻斷,提示在上述兩種細胞中C／EBPs家族成員均參與了白細胞介素-1β與皮質醇誘導11β-HSD1Mrna表達作用。

7、
　　4.我們以HFL-1細胞為模型進一步研究了白細胞介素-1β誘導11β-HSD1Mrna表達的分子機制。結果表明:(1)NF-Kb轉錄激活抑制劑5HPP-33不能阻斷白細胞介素-1β對HFL1細胞11β-HSD1Mrna表達的誘導作用,但能夠阻斷白細胞介素-1β對炎癥介質前列腺素合成酶COX-2Mrna的誘導作用,提示白細胞介素-1β對11β-HSD1Mrna表達的促進作用與此經(jīng)典的炎癥通路無關。(2)將11β-HSD1啟動子

8、克隆并構建于報告基因質粒,轉染HFL-1細胞后測定其啟動子活性發(fā)現(xiàn),白細胞介素-1β能夠促進11βHSDl啟動子活性增加,此作用可以被CCAAT序列突變所阻斷。(3)Westernblotting分析結果表明,HFL-1細胞中主要表達C／EBPβ而幾乎不表達C／EBPα,白細胞介素-1β強烈誘導C／EBPβ的表達。(4)進一步用ChIP和EMSA技術研究發(fā)現(xiàn),白細胞介素11β促進C／EBPβ與11β-HSD1啟動子CCAAT序列的結合。

9、(5)轉染表達C／EBPβ質粒(pMSV-C／EBPβ)和表達拮抗C／EBP蛋白的質粒(CMV-500-A-C／EBP)分別可以模擬和阻斷白細胞介素-1β對11β-HSD1表達的誘導作用。以上結果提示,白細胞介素-lp主要通過C／EBPβ誘導HFL-1細胞11β-HSD1的表達。
　　5.我們以原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細胞為模型進一步研究了皮質醇誘導11β-HSD1Mrna表達的分子機制。結果表明:(1)皮質醇對11β-HSD1mR

10、NA表達的誘導作用能夠被糖皮質激素受體拮抗劑RU486阻斷,提示皮質醇誘導11β-HSD1表達的作用需要糖皮質激素受體的參與。(2)將11β-HSD1啟動子-報告基因質粒轉染細胞后測定其啟動子活性發(fā)現(xiàn),皮質醇能夠促進人羊膜成纖維細胞11β-HSDl啟動子活性增加,此作用可以分別被糖皮質激素反應元件(GRE)和CCAAT序列突變所削弱。(3)Westernblotting分析結果表明,人羊膜成纖維細胞中主要表達C／EBPa而少量表達C／E

11、BPβ,皮質醇對人羊膜成纖維細胞C／EBPα表達的誘導作用比較明顯。(4)進一步用ChIP和EMSA技術研究發(fā)現(xiàn),皮質醇促進Gra和C／EBPa分別與11β-HSDl啟動子的GRE和CCAAT序列的結合。(5)轉染CMV-500-A-C／EBP質?？梢韵魅跗べ|醇對11β-HSDl表達的誘導作用。以上結果提示,糖皮質激素受體和C／EBPa都參與了皮質醇對人羊膜成纖維細胞11β-HSDl表達的誘導作用。結論
　　本課題研究結果表明,妊

12、娠晚期人胎肺組織中表達11β-HSDl:白細胞介素-1β與皮質醇誘導11βHSD1基因表達的現(xiàn)象同時存在于HFL-1細胞和人羊膜成纖維細胞。皮質醇主要通過促進糖皮質激素受體Gra和C／EBPa分別與11β-HSD1基因啟動子糖皮質激素反應元件和C／EBP結合位點的結合誘導人羊膜成纖維細胞11β-HSDl基因表達;白細胞介素-1β主要通過促進C／EBPβ與11β-HSDl基因啟動子上C／EBP結合位點的結合誘導HFL-1細胞11β-HSD