板藍(lán)根顆粒及黃芪多糖粉調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫力和降低豬血液中PRRS殘留毒核酸載量的研究.pdf

1、豬藍(lán)耳病即豬繁殖與呼吸綜合征(pocrin reoductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬藍(lán)耳病毒引起的一種以妊娠母豬流產(chǎn)、各種年齡豬（特別是仔豬）呼吸障礙和大量死亡為特征的高度傳染性疾病[1]。PRRSV會(huì)在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中大量復(fù)制，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫調(diào)節(jié)紊亂，引起其他疾病的繼發(fā)感染。目前我國主要通過疫苗免疫來預(yù)防PRRS，藍(lán)耳疫苗現(xiàn)市面上主要有兩種，一種為PRRS滅活苗;一種為PRR

2、S弱毒苗（經(jīng)典毒株或高致病性毒株）。弱毒苗免疫效果較好，所以運(yùn)用較為廣泛，但弱毒苗本身存在散毒危險(xiǎn)，會(huì)在豬體內(nèi)存在殘留毒。因此尋求一種既能夠使用免疫效果較好的藍(lán)耳弱毒苗又能一定程度上減輕甚至凈化藍(lán)耳弱毒苗在豬體內(nèi)的殘留毒的方法尤為重要。
　　1、黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的研究。
　　目的:研究不同劑量的板藍(lán)根顆粒、黃芪多糖粉對小鼠免疫功能中的巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。方法:選取27只小鼠隨機(jī)分為9組，每組3

3、只小鼠。第1-8組的小鼠分別腹腔注射4種不同濃度的板藍(lán)根顆粒、黃芪多糖粉溶液，對照組注射生理鹽水，每天1次，連續(xù)4d，第8天腹腔注射可溶性淀粉，產(chǎn)生異源性吞噬，誘導(dǎo)產(chǎn)生巨噬細(xì)胞，第10d注入5％雞紅細(xì)胞1ml，讓小鼠自由活動(dòng)30min后處死小鼠吸取腹腔液于載玻片上，37℃溫箱中孵育后瑞式染色鏡檢，測定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化。結(jié)果:兩種藥物均能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能;板藍(lán)根顆粒在20mg/ml、黃芪多糖粉在30mg/ml對小鼠的效

4、果最好，與對照組差異極顯著(P＜0.01)。
　　2、熒光定量RT-PCR檢測PRRSV核酸殘留毒方法建立
　　本試驗(yàn)通過對比分析PRRSV ORF7基因序列[3]，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)1對引物來人工合成靶基因，經(jīng)過擴(kuò)增得到的靶基因長度為162bp，條帶清晰，擴(kuò)增效果達(dá)到預(yù)期。將靶基因純化回收，通過連接轉(zhuǎn)化，制備重組質(zhì)粒pMD19-T-PRRSV，利用PCR方法進(jìn)行初步鑒定，在確定靶基因成功轉(zhuǎn)入DH5α后再進(jìn)行測序鑒定，而測序結(jié)果

5、與NCBI上登錄的PRRSV ORF7基因的同源性達(dá)100％，說明成功克隆了靶基因，同時(shí)將制備的重組質(zhì)粒抽提后測定其濃度作為熒光定量RT-PCR擴(kuò)增的模板。根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。同時(shí)通過優(yōu)化簡并引物濃度和退火溫度確定該方法的最佳反應(yīng)條件，成功建立了關(guān)于PRRSV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，簡并引物的設(shè)計(jì)更便于不同地區(qū)之間毒株的鑒定。經(jīng)過特異性、靈敏性以及重復(fù)性試驗(yàn)，該方法可以特異性的檢測到

6、pMD19-T-PRRSV，可檢測到的陽性質(zhì)粒模板的最低拷貝數(shù)為1.66×101 copies，陽性質(zhì)粒模板在組內(nèi)的變異系數(shù)均小于2％，表明該方法的特異性好，靈敏度高。為后期藥物試驗(yàn)監(jiān)控豬血液中PRRSV核酸載量變化量奠定了基礎(chǔ)。
　　3、黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒降低母豬血液中PRRSV殘留毒（或疫苗毒）的研究
　　目的:通過黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒的飼喂，檢測帶毒母豬血液中PRRSV殘留毒（或疫苗毒）的變化，初步揭示黃芪多糖粉

7、和板藍(lán)根顆粒降低豬血液中PRRS殘留毒（或疫苗毒）的能力，為生產(chǎn)實(shí)際上保證豬群健康提供參考和幫助，以利于黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒類中草藥添加劑的開發(fā)和應(yīng)用。方法:選取21頭經(jīng)檢測帶有PRRS殘留毒（或疫苗毒）的后備母豬，隨機(jī)分為3組，并于每組中各加入3頭不帶毒的健康母豬，即對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組。對照組飼喂普通飼料，試驗(yàn)1組使用黃芪多糖粉拌料飼喂，試驗(yàn)2組使用板藍(lán)根顆粒拌料飼喂。3個(gè)組試驗(yàn)?zāi)肛i分開飼喂，飼喂周期為兩個(gè)月，每十天進(jìn)行一次