Sonic Hedgehog信號通路活性下調參與人類肝細胞癌中5-FU抑癌作用的研究.pdf

1、山東大學博士學位論文SonicHedgehog信號通路活性下調參與人類肝細胞癌中5FU抑癌作用的研究姓名：王啟宇申請學位級別：博士專業(yè)：發(fā)育生物學指導教師：張紅衛(wèi)20081025作濃度。5FU作用于Hep3B細胞6h，12h，24h和48h時，通過半定量RTPCR檢測，發(fā)現(xiàn)5FU可以下調SHh通路靶基因P億J『(Patched“和Glil(gliomaassociatedoncogenehornolog”、配體基因SHH(SonicHe

2、dgehog)和受體基因SMO(Smoothened)的表達，表明5FU對Hep3B細胞中SHh信號通路的主要元件的基因轉錄有影響。而在SHh通路無活性的HepG2細胞中，沒有檢測到P陀J和Glil表達，配體SHH也沒有受到明顯影響。為確定SHh通路的活性是否參與5FU引發(fā)的生長阻滯和細胞凋亡，本研究通過pCS2Glil質粒使Hep3B細胞過表達Glil，用MTT檢測發(fā)現(xiàn)，當施加相同濃度的5FU時，轉染組比非轉染組的Hep3B細胞具有更

3、高的生長曲線；臺盼藍染色實驗更是直接驗證了MTT的檢測結果；吖啶橙熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)，除了細胞核發(fā)生了明顯的凝縮、邊緣化和片段化，并有凋亡小體出現(xiàn)外，5FU處理48h的轉染組比非轉染組的細胞凋亡比例明顯減少；而用Hochest33258的熒光檢測，除了發(fā)現(xiàn)細胞核在形態(tài)上有明顯的凋亡特征外，還發(fā)現(xiàn)5FU處理組比對照組的亮度強很多，熒光強度比較顯著(幸，p005)，而Glil轉染組的Hep3B細胞與對照組相比，雖然熒光強度有所增強，但程度不明

4、顯；用TUNEL檢測以及相應的熒光強度的統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，實驗中Glil轉染組中TUNEL陽染的細胞數(shù)量減少，而未轉染Glil的實驗組中陽染的細胞數(shù)量較多，5FU引發(fā)的凋亡更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，和對照組以及5FU處理的非轉染組相比，轉染組Hep3B細胞中Glil的過表達可以拮抗5FU引發(fā)的細胞生長阻滯和細胞凋亡。使Hep3B細胞過表達Glil，從而上調SHh通路活性上調，可在一定程度上降低Hep3B細胞對5FU的敏感性，增強Hep3B細胞

5、對5FU的拮抗作用。本研究的劃痕損傷愈合實驗發(fā)現(xiàn)，使Hep3B細胞過表達Glil可以拯救5FU引起的遷移能力的降低，表明在SHh通路激活的腫瘤細胞中5FU對細胞遷移能力的影響可能涉及對通路活性的抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達Glil的Hep3B細胞可以拮抗5FU引發(fā)的PTCl蛋白亞細胞定位的改變。本研究用熒光免疫細胞化學檢測法(ICC，Immunocytochemistry)對Hep3B細胞中PTCl蛋白的亞細胞定位的變化進行了檢測，發(fā)現(xiàn)