肝細(xì)胞癌及其癌前病變組織中相關(guān)抑癌基因的遺傳學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一；發(fā)病率居第五位，在癌癥死亡原因中居第三位。近來(lái)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示其發(fā)病具有顯著的地域差異，全世界80％的病例分布在亞洲、非洲等發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)；而在北歐、西歐和北美等地區(qū)其發(fā)病率較低，但最近幾年HCC在這些地區(qū)的發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。HCC的發(fā)生發(fā)展不僅和環(huán)境因素有關(guān)，如乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感

2、染、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)感染、黃曲霉毒素(aflatoxins,AFT)、酒精和煙草等；另外，遺傳因素也起到重要作用。近年來(lái)對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究表明，原癌基因的激活和抑癌基因的失活是該腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。許多研究發(fā)現(xiàn)在HCC組織中染色體1p、4q、6q、8p、13q、16q和17p的特定區(qū)域存在高頻率雜合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)，在發(fā)生染色體LOH的位點(diǎn)附近可能存

3、在與HCC發(fā)生相關(guān)的腫瘤抑制基因。還有研究發(fā)現(xiàn)在HCC發(fā)生的早期，異型增生結(jié)節(jié)(dysplasticnodules,DNs)和肝細(xì)胞腺瘤(hepatocellularadenoma,HA)等病變中也發(fā)生了與HCC類(lèi)似的遺傳學(xué)變異，并且因此被認(rèn)為是HCC的癌前病變；這些病變組織中染色體8p、17p、5p、13q、14q和16q等區(qū)域也存在基因片段的缺失，這就表明在HCC中出現(xiàn)的遺傳學(xué)改變有可能會(huì)出現(xiàn)在肝癌癌前病變中。因此，我們不僅要對(duì)HC

4、C，同時(shí)也要對(duì)其癌前病變進(jìn)展過(guò)程中所涉及的遺傳學(xué)改變進(jìn)行深入的探討，為HCC的診治提供更為精確的理論依據(jù)。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)染色體4q和8p上具有高度多態(tài)性的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在HCC和變異肝細(xì)胞結(jié)節(jié)(nodulesofalteredhepatocytes,NAH)標(biāo)本中LOH率的檢測(cè)，并在蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步檢測(cè)目的基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，分析研究與HCC及NAH發(fā)生發(fā)展相關(guān)的抑癌基因。為HCC的預(yù)防、早期診斷和治療提供

5、精確的分子標(biāo)志物。
　　方法：
　　1、收集HCC標(biāo)本和NAH標(biāo)本；采用顯微切割方法選出NAH細(xì)胞，和HCC標(biāo)本一起用等體積酚氯仿抽提基因組DNA；
　　2、對(duì)所選出的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)D4S2954、D4S3331、D4S3030、D4S415、D8S1725、D8S1754、D8S1810、D8S1827、D8S552，依據(jù)在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreac

6、tion,PCR)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，然后分析個(gè)各位點(diǎn)LOH的發(fā)生率，選出在HCC和NAH中LOH發(fā)生率較高的位點(diǎn)，并查找其所對(duì)應(yīng)的基因；
　　3、應(yīng)用S-P免疫組織化學(xué)法檢測(cè)目的基因編碼蛋白質(zhì)在HCC組織、NAH組織及其各自正常對(duì)照組織中的表達(dá)情況，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1、在45例信息性HCC病例中，9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)總的染色體LOH率為66.7％；其中D8S552位點(diǎn)的LOH率最高位41

7、.9％；通過(guò)χ2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.05)，得出該位點(diǎn)在性別(P=0.023)，血清甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)(P=0.004)和有無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(P=0.023)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；D4S415是22.5％，D4S3331是22.3％，D8S1810是18.8％，D4S2954和D4S3030是15.4％，D8S1725是12.5％，D8S1827是9.8％,D8S1754是6.3％；

8、r>　　2、在38例變NAH標(biāo)本中微衛(wèi)星位點(diǎn)D8S552的LOH發(fā)生頻率為7.89％；
　　3、45例HCC中12例肝經(jīng)常性丟失基因(deletedinlivercancer1gene，DLC-1)編碼的蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為26.7％；相對(duì)應(yīng)的自身癌旁組織36例DLC-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為80％；對(duì)兩種組織中蛋白的表達(dá)率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2=25.71,P<0.05)，DLC-1在HCC和癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DL

9、C-1蛋白在HCC中的表達(dá)在不同的年齡、性別中無(wú)差異，腫瘤的大小、是否有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、是否伴有肝硬化及血清乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)水平均無(wú)差別；
　　4、在38例NAH標(biāo)本中檢測(cè)DLC-1蛋白表達(dá)，陽(yáng)性的有26例，陽(yáng)性率為68.42％。正常對(duì)照組織中有30例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為78.9％。對(duì)兩種組織中蛋白的表達(dá)率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(P=0.442,P>0.05)，該蛋白在NAH和正常肝組

10、織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、染色體4q和8p上的三個(gè)位點(diǎn)D4S415、D4S3331和D8S552的雜合性缺失是HCC發(fā)生中的重要事件，提示幾個(gè)位點(diǎn)的附近可能存在著與HCC相關(guān)的潛在抑癌基因；并且為HCC相關(guān)的其他抑癌基因研究提供理論依據(jù)；
　　2、微衛(wèi)星位點(diǎn)D8S552在NAH組織中發(fā)生了LOH，提示NAH病變可能為HCC的一種癌前病變；
　　3、DLC-1蛋白在HCC組織中的表達(dá)水平顯著