結(jié)核分枝桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD-E基因缺失株的構(gòu)建及功能的初步研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是導(dǎo)致人類結(jié)核病(tuberculosis，TB)的病原菌，全世界大約有三分之一的人口潛伏感染結(jié)核分枝桿菌。有研究表明，雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用，并參與細(xì)菌毒力的調(diào)節(jié)，但具體的作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究在結(jié)核分枝桿菌中缺失了雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E，并對(duì)該系統(tǒng)在入侵巨噬細(xì)胞、胞內(nèi)存活以及毒力調(diào)節(jié)過程中的作用進(jìn)行了研究。

2、
　　1.雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E基因缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　構(gòu)建目的基因等位交換底物并克隆到含有溫敏型分枝桿菌噬菌體元件的穿梭載體phAE159上，等位交換底物經(jīng)噬菌體高效傳遞到待敲除菌株中。利用潮霉素抗性篩選陽性克隆子并通過PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E基因缺失株△kdpD、△kdpE、ΔkdpDE構(gòu)建成功。
　　2.基因缺失株與野生株生物學(xué)特性的比較
　　本研究通過測定缺失

3、株與野生株OD600以及CFU與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線，發(fā)現(xiàn)雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E的缺失對(duì)菌株的生長未造成明顯的影響。實(shí)驗(yàn)還比較了基因缺失株和野生株在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，結(jié)果顯示ΔkdpE、ΔkdpDE的索狀結(jié)構(gòu)明顯強(qiáng)于野生株，索狀結(jié)構(gòu)的變化預(yù)示著基因缺失株毒力的上升。
　　3.基因缺失株與野生株入侵巨噬細(xì)胞能力以及胞內(nèi)存活能力的比較
　　在人單核巨噬細(xì)胞(THP-1)感染實(shí)驗(yàn)中，通過測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的CFU，本研究發(fā)現(xiàn)雙

4、組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD/E的缺失對(duì)菌株入侵巨噬細(xì)胞沒有造成顯著影響，但在感染細(xì)胞后24h、48h、72h時(shí)缺失株ΔkdpDE都表現(xiàn)出更強(qiáng)的胞內(nèi)存活能力。
　　4.KdpE蛋白的表達(dá)以及多克隆抗體的制備
　　利用pET-28a載體成功表達(dá)了反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白KdpE。將純化后的蛋白免疫日本大耳兔，制備了兔抗KdpE蛋白多克隆抗體，ELISA結(jié)果顯示抗體效價(jià)可以達(dá)到1∶64，000。這些工作為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpD

5、/E的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　5.熒光定量PCR篩選差異表達(dá)基因
　　通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)KdpD/E缺失后，參與Kdp-ATPase K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)組成的基因kdpA、kdp表達(dá)量顯著上調(diào);與抵御不良環(huán)境及致病相關(guān)的基因lprF、lpr、lat、ponA2、espA表達(dá)量也顯著上調(diào)，而furA、glyA2、Rv3161c表達(dá)量顯著下調(diào)，這些基因的差異表達(dá)與KdpD/E基因缺失株胞內(nèi)存活能力以及毒力的增強(qiáng)聯(lián)系密切。