H2S對大鼠缺血性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 通過在體實(shí)驗(yàn)觀察外源性硫化氫(H2S)對大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞和大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞在缺血損傷時的保護(hù)作用，并探討相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)40只雄性wistar大鼠隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組、缺血組、H2S組、缺血+H2S組，每組10只。采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎(2VO)的方法建立慢性腦缺血大鼠模型；H2S組和缺血+H2S組大鼠給予腹腔注射NaHS(5.6mg/kg/day)處理。利用Morr

2、is水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)觀察比較各組大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力；各組大鼠在MWM測試后分別斷頭取腦，測定海馬內(nèi)H2S含量；通過組織學(xué)方法(HE染色)觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 (2)32只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分組及處理方法同(1)。在體記錄各組大鼠海馬CA3、CAl區(qū)的局部場電位，用計算神經(jīng)生物學(xué)方法分析大鼠海馬CA3、CA1區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的振蕩模態(tài)(包括θ波段和γ波段)并進(jìn)行比較；分別在

3、體記錄各組大鼠海馬CA1區(qū)的長時程增強(qiáng)(LTP)，并用免疫組織化學(xué)法觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)生長相關(guān)蛋白(GAP-43)的表達(dá)情況。
　　 (3)40只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組，H2S組，腫瘤組，腫瘤+H2S組，每組10只。選用大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，通過紋狀體內(nèi)微量細(xì)胞注射的方法建立大鼠惡性膠質(zhì)瘤(GBM)動物模型，H2S組和腫瘤+H2S組大鼠在腦內(nèi)注射1周后給予腹腔注射NaHS(5.6mg/k

4、g)1次；腦內(nèi)注射3周后，各組大鼠分別斷頭取腦，腫瘤側(cè)半腦用于制備冰凍切片，HE染色觀察瘤內(nèi)細(xì)胞形態(tài)，并計算瘤體體積；免疫組化染色觀察瘤內(nèi)血管內(nèi)皮標(biāo)記蛋白CD34、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)的陽性表達(dá)情況，評估瘤體內(nèi)微血管密度(MVD)；腫瘤對側(cè)半腦用于腦內(nèi)H2S含量測定。
　　 結(jié)果:
　　 (1)慢性腦缺血大鼠海馬內(nèi)H2S含量顯著降低(缺血組vs.假手術(shù)組，P<0.05)；經(jīng)

5、外源性H2S處理后，慢性腦缺血大鼠海馬內(nèi)的H2S含量顯著升高(缺血+H2S組vs.缺血組，P<0.05)，但仍低于假手術(shù)組(缺血十H2S組vs.假手術(shù)組，P<0.05)。
　　 (2)MWM結(jié)果表明，與假手術(shù)組大鼠相比，缺血組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，目標(biāo)象限百分比顯著減少(P<0.001)，穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.001)；經(jīng)外源性H2S腹腔注射處理后，缺血+H2S組大鼠的逃避潛伏期(秒)明顯縮短(定位巡

6、航第5天，缺血組與缺血+H2S組相比為：15.91±2.51 vs。8.09±1.50，P<0.01)，目標(biāo)象限百分比(％)明顯增加(缺血組與缺血+H2S組相比為：27.27±3.37 vs.37.25±3.92，P<0.05)，穿越平臺次數(shù)(次)顯著增加(缺血組與缺血+H2S組相比為：1.83±0.27vs.3±0.46，P<0.05)。四組大鼠的平均游泳速度無顯著性差別(P>0.05)。
　　 (3)假手術(shù)組和H2S組的CA

7、1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)正常。缺血組海馬的CA1區(qū)錐體細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核固縮現(xiàn)象，胞漿染色不均，難以分辨正常的胞體形態(tài)，細(xì)胞周圍可見明顯水腫，細(xì)胞分布散亂不均；缺血+H2S組海馬的CA1區(qū)錐體細(xì)胞也可見核固縮現(xiàn)象，但明顯少于缺血組，細(xì)胞分布趨于均勻，胞周水腫也明顯減少，胞漿染色也較均勻，可見多數(shù)錐體細(xì)胞的形態(tài)趨于正常。
　　 (4)對局部場電位的計算神經(jīng)生物學(xué)分析結(jié)果表明，缺血會導(dǎo)致CA3與CA1之間的θ節(jié)律和γ節(jié)律相位同步性顯著減弱，給

8、予H2S后，兩個腦區(qū)減弱的相位同步得到顯著恢復(fù)。缺血導(dǎo)致CA3-CA1通路θ與γ節(jié)律上的信息流單方向指數(shù)c2的顯著下降，而給予H2S后，這種下降趨勢得到恢復(fù)。
　　 (5)與假手術(shù)組相比，缺血組的場興奮性突觸后電位(fEPSPs)斜率百分比顯著降低(123.33±2.62 vs.112.35±2.52，P<0.001)，在使用外源性H2S處理后，缺血+H2S組大鼠的fEPSPs斜率百分比得到明顯提高(缺血+H2S組vs.缺血組：

9、124.99±3.64 vs.112.35±2.52，P<0.001)。
　　 (6)GAP-43主要表達(dá)于錐體細(xì)胞的胞體及其附近，缺血組的GAP-43陽性表達(dá)最低，缺血+H2S組的GAP-43陽性表達(dá)介于假手術(shù)組和缺血組之間。缺血組與假手術(shù)組比較，P<0.001；缺血組與缺血+H2S組比較，P<0.001。
　　 (7)一次性給予低劑量NaHS(5.6mg/kg)可促進(jìn)荷瘤鼠GBM瘤體的生長，表現(xiàn)為瘤體體積明顯增大(P

10、<0.001)，瘤體組織出現(xiàn)空洞，壞死、出血明顯增多，新生血管明顯增多。
　　 (8)腫瘤+H2S組與腫瘤組大鼠腦內(nèi)H2S的含量均高于假手術(shù)組(P<0.05)，腫瘤+H2S組H2S含量比腫瘤組顯著提高(P<0.05)；腫瘤+H2S組大鼠腦內(nèi)的CD34的陽性表達(dá)明顯高于腫瘤組(P<0.001)；腫瘤組和腫瘤+H2S組瘤內(nèi)的MVD(條/mm2)測定結(jié)果分別為41.2±7.9和97.0±10.8，具有極顯著性差異，P<0.001；與腫

11、瘤組相比，腫瘤+H2S組大鼠瘤體內(nèi)HIF-1α和MMP-2的陽性表達(dá)量均顯著增多(P<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)外源性H2S可提高缺血大鼠模型海馬內(nèi)H2S的含量；
　　 (2)外源性H2S可改善慢性腦缺血大鼠的空間認(rèn)知障礙，其機(jī)制與H2S可改善慢性腦缺血導(dǎo)致的大鼠海馬錐體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常有關(guān)；
　　 (3)慢性腦缺血可造成海馬內(nèi)慢γ振蕩與θ振蕩模態(tài)的改變；外源性H2S可使慢性腦缺血導(dǎo)致的

12、θ與γ模態(tài)改變得到一定程度的恢復(fù)，這有可能是H2S對抗慢性腦缺血認(rèn)知損傷的一個新的機(jī)制；
　　 (4)H2S可增強(qiáng)慢性腦缺血時大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元LTP，這是H2S改善腦缺血導(dǎo)致的大鼠空間認(rèn)知障礙的神經(jīng)電生理機(jī)制，這種電生理作用與H2S促進(jìn)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GAP-43的表達(dá)有關(guān)；
　　 (5)一次性給予低劑量(5.6mg/kg)的外源性H2S可促進(jìn)GBM瘤體的血管新生，促進(jìn)瘤體的生長，其機(jī)制與外源性H2S促進(jìn)瘤體