以果蠅表達(dá)栽體系統(tǒng)構(gòu)建可高效表達(dá)RSV G、RSV M的S2細(xì)胞株.pdf

1、人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，RSV)是全世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒，老年人、心肺病人及免疫缺陷病人下呼吸道疾病最重要的病原，是一種非分節(jié)段，負(fù)鏈RNA包膜病毒，屬于副黏液病毒科。病毒基因組全長(zhǎng)15.2kb，共有10個(gè)基因，可編碼11種蛋白。其中，黏附蛋白(Glycoprotein，G)為RSV主要中和抗原，基質(zhì)蛋白(Matrix protein，M)則在病毒的裝配，出芽及病毒顆粒的形成

2、中扮演著重要角色。因此，對(duì)RSVG蛋白、M蛋白的大量表達(dá)與純化，是Rsv診斷試劑，亞單位疫苗及病毒樣顆粒(VLPs)疫苗研制中需要首要解決的問題。
　　Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是制備RSV主要蛋白的常規(guī)方法，但存在純化困難及操作繁瑣等問題。而果蠅表達(dá)系統(tǒng)(Drosophila expression system)采用簡(jiǎn)單的載體及直接的轉(zhuǎn)染方法，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，可以較好地彌補(bǔ)桿狀病毒系統(tǒng)的缺陷，同時(shí)也能夠生產(chǎn)高表達(dá)

3、水平的重組蛋白。
　　本論文采用果蠅表達(dá)載體系統(tǒng)，構(gòu)建了可高效表達(dá)RSV G、RSV M的四種S2細(xì)胞株。將目的基因通過PCR擴(kuò)增獲得含信號(hào)肽的目的基因，與T載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并小提質(zhì)粒，測(cè)序，酶切，回收目的基因，將其克隆進(jìn)果蠅表達(dá)載體pMT/V5-His A中，獲得帶有目的基因的重組質(zhì)粒，酶切后進(jìn)行凝膠電泳鑒定；大提重組質(zhì)粒后，將其與抗性篩選質(zhì)粒pCoHygro共同進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞；轉(zhuǎn)染完成后，采用300μ