耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食大鼠骨骼肌表型適應(yīng)的分子機(jī)制.pdf

1、骨骼肌由慢縮肌纖維和快縮肌纖維組成。根據(jù)肌球蛋白ATP酶染色或/和肌球蛋白重鏈(myosinheavychain，MHC)異構(gòu)體的表達(dá)，成年嚙齒動(dòng)物骨骼肌纖維可單純地分為I型(氧化型慢縮肌)和IIa型(糖氧化型快縮肌)、IIb型(糖酵解型快縮肌)、IIx型(介于IIa與IIb之間)。骨骼肌既是執(zhí)行運(yùn)動(dòng)及調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的重要器官，也是一高度可塑性器官。對(duì)不同的代謝功能需求和代謝變化(如運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)的改變)，骨骼肌纖維大小和

2、類型可產(chǎn)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變。人類許多代謝疾病如糖尿病等可出現(xiàn)肌萎縮、肌纖維類型改變，探究影響骨骼肌纖維轉(zhuǎn)換和纖維大小的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路及它們之間的對(duì)話可為肌萎縮/病理性肥大相關(guān)疾病、殘疾康復(fù)、糖尿病等代謝疾病的治療及預(yù)防開發(fā)新藥靶位點(diǎn)。 運(yùn)動(dòng)和膳食是影響骨骼肌表型的重要因素。我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食影響骨骼肌纖維類型和纖維大小。已清楚鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)/活化T細(xì)胞核因子(NFATc1

3、)是調(diào)節(jié)骨骼肌纖維轉(zhuǎn)換的重要通路，而AKt/S6K1/GSK-3是調(diào)節(jié)骨骼肌大小的重要通路，但兩者是否參與了耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食時(shí)骨骼肌表型的改變以及兩通路間是否存在聯(lián)系目前并不清楚。本研究擬通過二個(gè)在體實(shí)驗(yàn)探討骨骼肌表型轉(zhuǎn)變時(shí)CaN信號(hào)和AKt信號(hào)通路分子的活性變化及其聯(lián)系。 第一章 耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食對(duì)大鼠骨髂肌表型的交互影響 目的:明確大鼠不同類型骨骼肌在短期耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食后肌纖維表型的適應(yīng)性變化，為下一步研究提

4、供依據(jù)。 方法: 40只雄性SD大鼠(重150～180g)單純隨機(jī)等分為四組：正常飼養(yǎng)不訓(xùn)練組(正常組)、高脂飼養(yǎng)不訓(xùn)練組(高脂組)、正常飼養(yǎng)訓(xùn)練組(運(yùn)動(dòng)組)、高脂飼養(yǎng)訓(xùn)練組(高脂運(yùn)動(dòng)組)。正常膳食熱卡(14.5KJ/g)配方為：碳水化合物占66％，蛋白質(zhì)占21％，脂肪占13％；高脂膳食熱卡(21KJ/g)配方：碳水化合物占20％，蛋白質(zhì)占21％，脂肪占59％(以豬油為主)。運(yùn)動(dòng)方式：在坡度為0的電動(dòng)跑臺(tái)(有尾電激)進(jìn)行

5、訓(xùn)練(訓(xùn)練完后立即投食，次日晨8:00移去食物)，速度由20米/分遞增至28米/分，每次運(yùn)動(dòng)1小時(shí)，每周6次，共6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前三天，進(jìn)行腹腔糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取空腹血用比色法分析空腹血糖(FBS)、甘油三酯(FTG)、游離脂肪酸(FFA)、血漿總氨基酸(FAA)，用放免法測(cè)空腹血漿胰島素(FINS)。取大網(wǎng)膜脂肪、腎周脂肪和睪周脂肪作為腹內(nèi)脂肪含量稱重。取雙側(cè)比目魚肌(SOL)和趾長(zhǎng)伸肌(EDL)，右側(cè)肌稱重后用MH

6、CSDS-PAGE電泳法、肌纖維ATPase染色法測(cè)定纖維類型和纖維橫斷面積，用比色法測(cè)定琥珀酸脫氫酶(SDH)、β-羥酰輔酶A脫氫酶(HADH)活性。 結(jié)果: 1.6周的高脂膳食顯著增加大鼠腹內(nèi)脂肪含量、降低腹腔糖耐量，耐力運(yùn)動(dòng)則明顯降低高脂膳食誘導(dǎo)的腹內(nèi)脂肪積聚(高脂膳食組為13.56±6.54g，高脂運(yùn)動(dòng)組為7.63±2.15g，P<0.05)、改善高脂膳食損害的腹腔糖耐量(高脂膳食組為27.14±3.40，高脂運(yùn)

7、動(dòng)組為21.80±1.67，P<0.05)。 2.耐力運(yùn)動(dòng)升高趾長(zhǎng)伸肌的SDH活性和HADH活性；而高脂膳食降低比目魚肌的SDH活性，增加趾長(zhǎng)伸肌的HADH活性。 3.高脂膳食升高空腹血漿胰島素濃度；耐力運(yùn)動(dòng)后攝入正常膳食和高脂膳食空腹血漿胰島素不下降(正常組和運(yùn)動(dòng)組分別為10.67±3.59、12.18±3.34uIU/mL；高脂膳食組和高脂運(yùn)動(dòng)組分別為15.12±5.91、17.98±7.88uIU/mL)。

8、 4.6周的無坡度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)生長(zhǎng)期大鼠比目魚肌向慢肌纖維轉(zhuǎn)換，高脂膳食傾向降低耐力運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的比目魚肌向慢肌纖維轉(zhuǎn)換，但不影響趾長(zhǎng)伸肌纖維類型。 5.耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食增加生長(zhǎng)期大鼠比目魚肌質(zhì)量，但不影響比目魚肌纖維橫斷面積；耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食對(duì)趾長(zhǎng)伸肌質(zhì)量有交互影響，且耐力運(yùn)動(dòng)增加趾長(zhǎng)伸肌TypeI纖維橫斷面積，高脂膳食降低趾長(zhǎng)伸肌TypeI、TypeIIb纖維橫斷面積。 6.空腹血漿胰島素濃度與比目魚肌質(zhì)量相關(guān)(rs

9、=0.37，P=0.040)，但與比目魚肌的纖維類型、趾長(zhǎng)伸肌質(zhì)量和纖維類型相關(guān)無顯著性意義。 結(jié)論: 1.高脂膳食損害腹腔糖耐量，而耐力運(yùn)動(dòng)改善腹腔糖耐量。 2.耐力運(yùn)動(dòng)同步提高骨骼肌脂肪酸β氧化能力和線粒體氧化能力，而高脂膳食僅升高脂肪酸β氧化能力。 3.耐力運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)生長(zhǎng)期大鼠比目魚肌纖維轉(zhuǎn)換。 4.耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食可影響骨骼肌質(zhì)量和肌纖維橫斷面積。 第二章 耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食對(duì)大

10、鼠骨骼肌Calcineurin和Akt信號(hào)通路影響 目的:探討耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食引發(fā)骨骼肌表型改變時(shí)是否與Akt信號(hào)通路和CaN-NFATc1信號(hào)通路有關(guān)。 方法: 左側(cè)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌用WesternBlotting法測(cè)定磷酸化Akt、磷酸化S6K1、GSK-3和CaN、胞核NFATc1信號(hào)蛋白分子含量，同時(shí)用比色法測(cè)肌肉CaN活性、同位素法測(cè)肌肉GSK-3活性。 結(jié)果: 1.耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳

11、食對(duì)比目魚肌基礎(chǔ)P-Akt(Ser473)和趾長(zhǎng)伸肌基礎(chǔ)P-S6K1(Thr389)蛋白含量增加有交互影響。耐力運(yùn)動(dòng)增加高脂膳食時(shí)比目魚肌基礎(chǔ)P-Akt(Ser473)和趾長(zhǎng)伸肌P-S6K1(Thr389)蛋白含量，而高脂膳食增加比目魚肌基礎(chǔ)P-S6K1(Thr389)蛋白含量。 2.耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食增加趾長(zhǎng)伸肌基礎(chǔ)胞漿6SK-3蛋白含量，耐力運(yùn)動(dòng)降低比目魚肌基礎(chǔ)胞核GSK-3蛋白含量。 3.高脂膳食增加比目魚肌基礎(chǔ)胞

12、漿GSK-3活性；耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食對(duì)比目魚肌基礎(chǔ)胞核GSK-3活性有交互影響；耐力運(yùn)動(dòng)降低趾長(zhǎng)伸肌基礎(chǔ)胞漿GSK-3活性。 4.耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食不影響比目魚肌基礎(chǔ)胞漿和胞核CaN活性；耐力運(yùn)動(dòng)增加趾長(zhǎng)伸肌基礎(chǔ)胞漿CaN活性，而高脂膳食降低其活性。 5.耐力運(yùn)動(dòng)降低比目魚肌胞核NFATc1蛋白含量；耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食對(duì)趾長(zhǎng)伸肌胞核NFATc1蛋白含量有交互影響。耐力運(yùn)動(dòng)增加趾長(zhǎng)伸肌胞核NFATc1蛋白含量，而高脂膳食損

13、害運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的趾長(zhǎng)伸肌胞核NFATc1蛋白增加幅度。 結(jié)論: 1.耐力運(yùn)動(dòng)增加趾長(zhǎng)伸肌基礎(chǔ)CaN活性，而高脂膳食降低其活性；耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食不影響比目魚肌基礎(chǔ)CaN活性。 2.耐力運(yùn)動(dòng)和高脂膳食可影響比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌AKt/S6K1/GSK-3信號(hào)通路，但具有肌肉特異性。 第三章 環(huán)孢素A對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌表型及其相關(guān)信號(hào)通路影響 目的:明確CaN-NFATC1在耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)肌纖維表型改變中的作

14、用，以及它對(duì)Akt信號(hào)通路的影響。 方法: 16只訓(xùn)練大鼠第三周末隨機(jī)進(jìn)一步分成二組，其中一組加用環(huán)孢素(環(huán)孢素運(yùn)動(dòng)組，每天于運(yùn)動(dòng)前1～2小時(shí)皮下注射環(huán)孢素A，劑量為15mg/Kg體重)，對(duì)照運(yùn)動(dòng)組注射等量生理鹽水(運(yùn)動(dòng)組)。同時(shí)以實(shí)驗(yàn)一的正常組作為不運(yùn)動(dòng)對(duì)照組。訓(xùn)練方法同前。第6周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取材和測(cè)試指標(biāo)、測(cè)試方法同前。 結(jié)果: 1.環(huán)孢素阻礙耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)比目魚肌慢肌比例的增加(運(yùn)動(dòng)組和環(huán)孢素運(yùn)動(dòng)組MH

15、CI比例分別為93.4±6.0％、79.3±8.4％，P=0.007)，同時(shí)顯著降低I型纖維橫斷面積(正常組、運(yùn)動(dòng)組、環(huán)孢素運(yùn)動(dòng)組分別為3763.0±386.9、4047.2±201.7、2753.5±244.3μm2，P=0.000)。 2.環(huán)孢素對(duì)無坡度跑臺(tái)訓(xùn)練大鼠趾長(zhǎng)伸肌纖維類型無顯著影響，顯著降低各型肌纖維橫斷面積(I、IIax和IIb型在正常組、運(yùn)動(dòng)組、環(huán)孢素運(yùn)動(dòng)組分別為1296.8±331.7、1530.5±133.

16、3、902.8±99.2μm2，P=0.001；2436.5±420.4、2587.2±294.8、1797.5±174.5μm2，P=0.002:4694.2±238.7、4345.2±372.8、2527.5±165.8μm2，P=0.000)，但增加趾長(zhǎng)伸肌相對(duì)質(zhì)量和肌原纖維蛋白濃度。 3.環(huán)孢素不影響耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌基礎(chǔ)P-Akt(Ser473)總含量，也不影響耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)胞漿和胞核GSK-3蛋白含量和活性，但

17、升高耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)趾長(zhǎng)伸肌P-S6K1(Thr389)含量。 結(jié)論: 1.環(huán)孢素阻礙耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)比目魚肌纖維轉(zhuǎn)換，并降低耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)肌纖維的橫斷面積。 2.環(huán)孢素不影響耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌總P-Akt(Ser473)含量和GSK-3活性變化。 全文結(jié)論: 1.CaN通路參與了耐力運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌纖維轉(zhuǎn)換。 2.CaN通路參與調(diào)節(jié)肌纖維橫斷面積，且環(huán)孢素反使耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)快肌肌原纖維蛋白濃度增加。 3.