耐力運動和高脂膳食大鼠骨骼肌表型適應的分子機制.pdf

1、骨骼肌由慢縮肌纖維和快縮肌纖維組成。根據(jù)肌球蛋白ATP酶染色或/和肌球蛋白重鏈(myosinheavychain，MHC)異構(gòu)體的表達，成年嚙齒動物骨骼肌纖維可單純地分為I型(氧化型慢縮肌)和IIa型(糖氧化型快縮肌)、IIb型(糖酵解型快縮肌)、IIx型(介于IIa與IIb之間)。骨骼肌既是執(zhí)行運動及調(diào)節(jié)機體葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的重要器官，也是一高度可塑性器官。對不同的代謝功能需求和代謝變化(如運動、營養(yǎng)的改變)，骨骼肌纖維大小和

2、類型可產(chǎn)生相應的適應性改變。人類許多代謝疾病如糖尿病等可出現(xiàn)肌萎縮、肌纖維類型改變，探究影響骨骼肌纖維轉(zhuǎn)換和纖維大小的細胞內(nèi)信號通路及它們之間的對話可為肌萎縮/病理性肥大相關疾病、殘疾康復、糖尿病等代謝疾病的治療及預防開發(fā)新藥靶位點。 運動和膳食是影響骨骼肌表型的重要因素。我們前期的預實驗結(jié)果顯示耐力運動和高脂膳食影響骨骼肌纖維類型和纖維大小。已清楚鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)/活化T細胞核因子(NFATc1

3、)是調(diào)節(jié)骨骼肌纖維轉(zhuǎn)換的重要通路，而AKt/S6K1/GSK-3是調(diào)節(jié)骨骼肌大小的重要通路，但兩者是否參與了耐力運動和高脂膳食時骨骼肌表型的改變以及兩通路間是否存在聯(lián)系目前并不清楚。本研究擬通過二個在體實驗探討骨骼肌表型轉(zhuǎn)變時CaN信號和AKt信號通路分子的活性變化及其聯(lián)系。 第一章 耐力運動和高脂膳食對大鼠骨髂肌表型的交互影響 目的:明確大鼠不同類型骨骼肌在短期耐力運動和高脂膳食后肌纖維表型的適應性變化，為下一步研究提

4、供依據(jù)。 方法: 40只雄性SD大鼠(重150～180g)單純隨機等分為四組：正常飼養(yǎng)不訓練組(正常組)、高脂飼養(yǎng)不訓練組(高脂組)、正常飼養(yǎng)訓練組(運動組)、高脂飼養(yǎng)訓練組(高脂運動組)。正常膳食熱卡(14.5KJ/g)配方為：碳水化合物占66％，蛋白質(zhì)占21％，脂肪占13％；高脂膳食熱卡(21KJ/g)配方：碳水化合物占20％，蛋白質(zhì)占21％，脂肪占59％(以豬油為主)。運動方式：在坡度為0的電動跑臺(有尾電激)進行

5、訓練(訓練完后立即投食，次日晨8:00移去食物)，速度由20米/分遞增至28米/分，每次運動1小時，每周6次，共6周。實驗結(jié)束前三天，進行腹腔糖耐量試驗(IPGTT)，實驗結(jié)束時取空腹血用比色法分析空腹血糖(FBS)、甘油三酯(FTG)、游離脂肪酸(FFA)、血漿總氨基酸(FAA)，用放免法測空腹血漿胰島素(FINS)。取大網(wǎng)膜脂肪、腎周脂肪和睪周脂肪作為腹內(nèi)脂肪含量稱重。取雙側(cè)比目魚肌(SOL)和趾長伸肌(EDL)，右側(cè)肌稱重后用MH

6、CSDS-PAGE電泳法、肌纖維ATPase染色法測定纖維類型和纖維橫斷面積，用比色法測定琥珀酸脫氫酶(SDH)、β-羥酰輔酶A脫氫酶(HADH)活性。 結(jié)果: 1.6周的高脂膳食顯著增加大鼠腹內(nèi)脂肪含量、降低腹腔糖耐量，耐力運動則明顯降低高脂膳食誘導的腹內(nèi)脂肪積聚(高脂膳食組為13.56±6.54g，高脂運動組為7.63±2.15g，P<0.05)、改善高脂膳食損害的腹腔糖耐量(高脂膳食組為27.14±3.40，高脂運

7、動組為21.80±1.67，P<0.05)。 2.耐力運動升高趾長伸肌的SDH活性和HADH活性；而高脂膳食降低比目魚肌的SDH活性，增加趾長伸肌的HADH活性。 3.高脂膳食升高空腹血漿胰島素濃度；耐力運動后攝入正常膳食和高脂膳食空腹血漿胰島素不下降(正常組和運動組分別為10.67±3.59、12.18±3.34uIU/mL；高脂膳食組和高脂運動組分別為15.12±5.91、17.98±7.88uIU/mL)。

8、 4.6周的無坡度跑臺運動促進生長期大鼠比目魚肌向慢肌纖維轉(zhuǎn)換，高脂膳食傾向降低耐力運動誘導的比目魚肌向慢肌纖維轉(zhuǎn)換，但不影響趾長伸肌纖維類型。 5.耐力運動和高脂膳食增加生長期大鼠比目魚肌質(zhì)量，但不影響比目魚肌纖維橫斷面積；耐力運動和高脂膳食對趾長伸肌質(zhì)量有交互影響，且耐力運動增加趾長伸肌TypeI纖維橫斷面積，高脂膳食降低趾長伸肌TypeI、TypeIIb纖維橫斷面積。 6.空腹血漿胰島素濃度與比目魚肌質(zhì)量相關(rs

9、=0.37，P=0.040)，但與比目魚肌的纖維類型、趾長伸肌質(zhì)量和纖維類型相關無顯著性意義。 結(jié)論: 1.高脂膳食損害腹腔糖耐量，而耐力運動改善腹腔糖耐量。 2.耐力運動同步提高骨骼肌脂肪酸β氧化能力和線粒體氧化能力，而高脂膳食僅升高脂肪酸β氧化能力。 3.耐力運動可誘導生長期大鼠比目魚肌纖維轉(zhuǎn)換。 4.耐力運動和高脂膳食可影響骨骼肌質(zhì)量和肌纖維橫斷面積。 第二章 耐力運動和高脂膳食對大

10、鼠骨骼肌Calcineurin和Akt信號通路影響 目的:探討耐力運動和高脂膳食引發(fā)骨骼肌表型改變時是否與Akt信號通路和CaN-NFATc1信號通路有關。 方法: 左側(cè)比目魚肌和趾長伸肌用WesternBlotting法測定磷酸化Akt、磷酸化S6K1、GSK-3和CaN、胞核NFATc1信號蛋白分子含量，同時用比色法測肌肉CaN活性、同位素法測肌肉GSK-3活性。 結(jié)果: 1.耐力運動和高脂膳

11、食對比目魚肌基礎P-Akt(Ser473)和趾長伸肌基礎P-S6K1(Thr389)蛋白含量增加有交互影響。耐力運動增加高脂膳食時比目魚肌基礎P-Akt(Ser473)和趾長伸肌P-S6K1(Thr389)蛋白含量，而高脂膳食增加比目魚肌基礎P-S6K1(Thr389)蛋白含量。 2.耐力運動和高脂膳食增加趾長伸肌基礎胞漿6SK-3蛋白含量，耐力運動降低比目魚肌基礎胞核GSK-3蛋白含量。 3.高脂膳食增加比目魚肌基礎胞

12、漿GSK-3活性；耐力運動和高脂膳食對比目魚肌基礎胞核GSK-3活性有交互影響；耐力運動降低趾長伸肌基礎胞漿GSK-3活性。 4.耐力運動和高脂膳食不影響比目魚肌基礎胞漿和胞核CaN活性；耐力運動增加趾長伸肌基礎胞漿CaN活性，而高脂膳食降低其活性。 5.耐力運動降低比目魚肌胞核NFATc1蛋白含量；耐力運動和高脂膳食對趾長伸肌胞核NFATc1蛋白含量有交互影響。耐力運動增加趾長伸肌胞核NFATc1蛋白含量，而高脂膳食損

13、害運動誘導的趾長伸肌胞核NFATc1蛋白增加幅度。 結(jié)論: 1.耐力運動增加趾長伸肌基礎CaN活性，而高脂膳食降低其活性；耐力運動和高脂膳食不影響比目魚肌基礎CaN活性。 2.耐力運動和高脂膳食可影響比目魚肌和趾長伸肌AKt/S6K1/GSK-3信號通路，但具有肌肉特異性。 第三章 環(huán)孢素A對耐力運動大鼠骨骼肌表型及其相關信號通路影響 目的:明確CaN-NFATC1在耐力運動時肌纖維表型改變中的作

14、用，以及它對Akt信號通路的影響。 方法: 16只訓練大鼠第三周末隨機進一步分成二組，其中一組加用環(huán)孢素(環(huán)孢素運動組，每天于運動前1～2小時皮下注射環(huán)孢素A，劑量為15mg/Kg體重)，對照運動組注射等量生理鹽水(運動組)。同時以實驗一的正常組作為不運動對照組。訓練方法同前。第6周末實驗結(jié)束，取材和測試指標、測試方法同前。 結(jié)果: 1.環(huán)孢素阻礙耐力運動時比目魚肌慢肌比例的增加(運動組和環(huán)孢素運動組MH

15、CI比例分別為93.4±6.0％、79.3±8.4％，P=0.007)，同時顯著降低I型纖維橫斷面積(正常組、運動組、環(huán)孢素運動組分別為3763.0±386.9、4047.2±201.7、2753.5±244.3μm2，P=0.000)。 2.環(huán)孢素對無坡度跑臺訓練大鼠趾長伸肌纖維類型無顯著影響，顯著降低各型肌纖維橫斷面積(I、IIax和IIb型在正常組、運動組、環(huán)孢素運動組分別為1296.8±331.7、1530.5±133.

16、3、902.8±99.2μm2，P=0.001；2436.5±420.4、2587.2±294.8、1797.5±174.5μm2，P=0.002:4694.2±238.7、4345.2±372.8、2527.5±165.8μm2，P=0.000)，但增加趾長伸肌相對質(zhì)量和肌原纖維蛋白濃度。 3.環(huán)孢素不影響耐力運動時比目魚肌和趾長伸肌基礎P-Akt(Ser473)總含量，也不影響耐力運動時胞漿和胞核GSK-3蛋白含量和活性，但

17、升高耐力運動時趾長伸肌P-S6K1(Thr389)含量。 結(jié)論: 1.環(huán)孢素阻礙耐力運動時比目魚肌纖維轉(zhuǎn)換，并降低耐力運動時肌纖維的橫斷面積。 2.環(huán)孢素不影響耐力運動時骨骼肌總P-Akt(Ser473)含量和GSK-3活性變化。 全文結(jié)論: 1.CaN通路參與了耐力運動誘導的肌纖維轉(zhuǎn)換。 2.CaN通路參與調(diào)節(jié)肌纖維橫斷面積，且環(huán)孢素反使耐力運動時快肌肌原纖維蛋白濃度增加。 3.