高脂飲食對老年大鼠骨骼肌和肝臟脂肪酸代謝及AMPK信號(hào)通路的影響.pdf

1、流行病學(xué)資料表明，2型糖尿病、脂肪肝和心血管疾病等慢性病隨著年齡的增長而增加。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是這些代謝性疾病的共同病理基礎(chǔ)。 本課題觀察了老年和高脂環(huán)境因素對大鼠骨骼肌和肝臟脂肪酸代謝及AMPK信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)和活性的影響，探討老年相關(guān)IR的可能機(jī)制。研究內(nèi)容包括以下三部分： 第一部分高脂飲食對老年大鼠骨骼肌和肝臟脂肪酸代謝及胰島素敏感性的影響 目的: 探討老年

2、和高脂飲食對大鼠骨骼肌和肝臟脂肪酸代謝的影響及其與IR的相關(guān)性，進(jìn)一步了解老年IR的發(fā)病機(jī)制。 方法: 22-24月齡雄性Wistar大鼠32只隨機(jī)分為老年對照組(OC組n=16)、高脂組(HF組，n=16)；4-5月齡大鼠16只作為青年對照組(YC組)。老年對照組和青年對照組給基礎(chǔ)飼料，熱量組成：碳水化合物65.5％，脂肪10.3％，蛋白質(zhì)24.2％，總熱量為348kcal/100g；高脂組給予高脂飼料，其熱量組成：碳水化合物

3、20.1％，脂肪59.8％，蛋白質(zhì)20.1％，總熱量為501kcal/100g。老年兩組大鼠每日等熱量投喂飼料，每周稱體重1次，喂養(yǎng)8周。第4周末從各組隨機(jī)選8只大鼠行高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)評價(jià)IR狀態(tài)。第8周末各組剩余8只大鼠再次行鉗夾實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前抽取血樣用于測定血清各項(xiàng)指標(biāo)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，立即取出股四頭肌和肝臟組織放入液氮中冷凍，然后保存于-70℃低溫冰箱。骨骼肌和肝臟甘油三酯經(jīng)氯仿/甲醇抽提后用全自動(dòng)生化分析儀

4、測定；骨骼肌長鏈脂酰CoA用熒光分光光度計(jì)測定。 結(jié)果: 1. 各組一般項(xiàng)目的比較：與青年對照組比較，老年對照組體重明顯增加(P<0.01)，但老年對照組和高脂組之間無差別(P>0.05)。老年對照組空腹血糖、胰島素和游離脂肪酸高于青年對照組，高脂組這幾項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)一步升高，并且出現(xiàn)血清甘油三酯和總膽固醇水平增高(P<0.05或p<0.01)。 2. 胰島素敏感性評價(jià)：分組喂養(yǎng)至4周及8周末，各組鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明老

5、年對照組GIR低于青年對照組，高脂組GIR低于老年對照組(P<0.05或p<0.01)；高脂組8周末GIR低于高脂組4周末(P<0.01)。 3. 老年對照組骨骼肌甘油三酯、長鏈脂酰CoA和肝臟甘油三酯含量高于青年對照組，高脂組與老年對照組相比進(jìn)一步升高(P<0.05或p<0.01)。 4. 相關(guān)分析表明：在老年兩組中，骨骼肌甘油三酯和長鏈脂酰CoA與GIR呈負(fù)相關(guān)，與空腹血糖及空腹胰島素呈正相關(guān)，長鏈脂酰CoA還與游離

6、脂肪酸和總膽固醇呈正相關(guān)；肝臟甘油三酯與GIR呈負(fù)相關(guān)，與空腹血糖呈正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論: 1. 老年大鼠骨骼肌和肝臟脂質(zhì)含量高于青年大鼠，葡萄糖輸注率低于青年大鼠，說明老年大鼠更易出現(xiàn)脂質(zhì)異位堆積和IR。 2. 高脂飲食導(dǎo)致老年大鼠骨骼肌和肝臟脂質(zhì)積聚更加嚴(yán)重，進(jìn)一步加重IR。 3. 骨骼肌和肝臟脂質(zhì)含量與葡萄糖輸注率呈負(fù)相關(guān)，說明骨骼肌和肝臟脂毒性可能參與了增齡和高脂飲食相關(guān)I

7、R的發(fā)生。 第二部分高脂飲食對老年大鼠骨骼肌和肝臟ACC與MCD表達(dá)及活性的影響 目的: 探討老年和高脂飲食對大鼠骨骼肌和肝臟ACC與MCD表達(dá)和活性的影響以及ACC和MCD在組織脂質(zhì)堆積和IR中的作用。 方法: 動(dòng)物分組及標(biāo)本留取同第一部分。ACC活性通過測定P-ACC蛋白表達(dá)水平來評價(jià)(P-ACC，即ACC的磷酸化狀態(tài)，代表ACC的非活性形式)。骨骼肌和肝臟ACC、P-ACC蛋白表達(dá)用Western-blot

8、方法測定；骨骼肌和肝臟MCD mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析技術(shù)；MCD活性：通過(NH4)2504沉淀提純蛋白，MCD活性用光譜法測定。 結(jié)果: 1. 老年對照組與青年對照組之間、高脂組與老年對照組之間骨骼肌和肝臟ACC蛋白表達(dá)均無明顯變化(P>0.05)；老年對照組骨骼肌和肝臟P-ACC蛋白水平均低于青年對照組，高脂組與老年對照組相比進(jìn)一步降低(P<0.05或P<0.01)。 2. 與青年對照組

9、比較，老年對照組骨骼肌MCD mRNA表達(dá)有降低的趨勢，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高脂組比老年對照組下降明顯(P<0.05)；老年對照組與青年對照組相比、高脂組與老年對照組比較，肝臟MCD mRNA表達(dá)均有降低的趨勢，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3. 老年對照組骨骼肌MCD活性低于青年對照組，高脂喂養(yǎng)后進(jìn)一步降低(P<0.05)；老年對照組與青年對照組相比、高脂組與老年對照組比較，肝臟MCD活性均有降低的趨勢

10、，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4. 相關(guān)性分析骨骼肌甘油三酯和長鏈脂酰CoA均與P-ACC蛋白水平呈負(fù)相關(guān)、與MCD活性呈負(fù)相關(guān)，長鏈脂酰CoA還與MCD表達(dá)具有相關(guān)性；肝臟甘油三酯與P-ACC蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論: 1. 與青年大鼠相比，老年大鼠骨骼肌和肝臟ACC活性增高，骨骼肌MCD活性下降。 2. 高脂飲食導(dǎo)致老年大鼠骨骼肌和肝臟ACC活性進(jìn)一步升高，骨骼

11、肌MCD mRNA表達(dá)下降、MCD活性進(jìn)一步降低。 3. 骨骼肌脂質(zhì)含量與ACC活性及MCD表達(dá)和活性具有相關(guān)性；肝臟甘油三酯含量與ACC活性呈正相關(guān)。 第三部分高脂飲食對老年大鼠骨骼肌和肝臟AMPKα表達(dá)及活性的影響 目的: 探討老年和高脂飲食對大鼠骨骼肌和肝臟AMPKα表達(dá)及活性的影響，進(jìn)一步揭示老年骨骼肌和肝臟脂質(zhì)堆積的分子機(jī)制。 方法: 動(dòng)物分組及標(biāo)本留取同第一部分。AMPKα活性通過測定P-AM

12、PKα蛋白表達(dá)水平來評價(jià)(P-AMPKα，即磷酸化AMPKα，代表AMPKα的活性形式)。AMPKa1和AMPKa2 mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析技術(shù)；AMPKa1、AMPKa2和P-AMPKα蛋白表達(dá)用Western-blot方法測定；骨骼肌AMP、ATP、肌酸和肌酸磷酸及肝臟AMP、ATP含量用高效液相色譜法測定。 結(jié)果: 1. 骨骼肌AMPKa1 mRNA表達(dá)在老年對照組與青年對照組之間、高脂組與老

13、年對照組之間比較均無差別(P>0.05)：骨骼肌AMPKα2mRNA表達(dá)在老年對照組低于青年對照組，高脂組低于老年對照組(P<0.05)。 2. 骨骼肌AMPKα1蛋白表達(dá)在三組之間無明顯差別；骨骼肌AMPKα2蛋白表達(dá)和P-AMPKα蛋白表達(dá)在老年對照組低于青年對照組，高脂組與老年對照組相比進(jìn)一步下降(P<0.05)。 3. 老年對照組與青年對照組相比、高脂組與老年對照組比較，肝臟AMPKα1的mRNA表達(dá)均有降低的趨

14、勢，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肝臟AMPKα2 mRNA表達(dá)在三組之間亦無差別(P>0.05)。 4. 肝臟AMPKα1和AMPKα2蛋白表達(dá)在三組之間無明顯差別(P>0.05)；肝臟P-AMPKα蛋白表達(dá)在老年對照組低于青年對照組，高脂組與老年對照組相比進(jìn)一步下降(P<0.05)。 5. 老年兩組相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)骨骼肌甘油三酯、長鏈脂酰CoA和肝臟甘油三酯含量均與P-AMPKα的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0

15、.644、-0.614和-0.737，P值均小于0.05。6 骨骼肌ATP、AMP在老年對照組與青年對照組之間無明顯差別，但高脂組均低于老年對照組(P<0.05或P<0.01)；骨骼肌PCr含量在老年對照組與青年對照組之間、高脂組與老年對照組之間均無明顯差別(P>0.05)；骨骼肌Cr在老年對照組低于青年對照組，高脂組低于老年對照組(P<0.01)；AMP/ATP及Cr/PCr比率在老年對照組低于青年對照組，高脂組低于老年對照組(P<0

16、.05)。7肝臟ATP含量在老年對照組與青年對照組之間、高脂組與老年對照組之間均無明顯差別；而AMP含量在老年對照組低于青年對照組，高脂組與老年對照組相比進(jìn)一步降低(P<0.01)。AMP/ATP比率在老年對照組低于青年對照組，高脂組低于老年對照組(P<0.05)。 結(jié)論: 1. 老年大鼠骨骼肌AMPKα2表達(dá)、AMPKα活性和肝臟AMPKα活性均低于青年大鼠。 2. 高脂飲食導(dǎo)致老年大鼠骨骼肌AMPKα2表達(dá)和