中慢生天山根瘤菌胞外多糖在共生過程中的功能研究.pdf

1、根瘤菌與宿主植物的共生結(jié)瘤過程，需要各種多糖類物質(zhì)的參與。根瘤菌能產(chǎn)生胞外多糖(EPS)、莢膜多糖(KPS)、脂多糖(LPS)和環(huán)狀葡聚糖四種多糖類物質(zhì)。根瘤菌體表的胞外多糖不僅具有富集環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)元素的功能，還對(duì)于無定型根瘤的共生固氮過程具有重要作用，它可以作為根瘤菌與宿主植物相互作用時(shí)的信號(hào)分子，在協(xié)助根瘤菌吸附宿主根毛，改變宿主根毛細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、促進(jìn)侵入線形成、決定宿主專一性、保護(hù)自身抵御宿主防御系統(tǒng)反應(yīng)等共生過程中具有更為復(fù)雜的作

2、用。因此，深入研究根瘤菌胞外多糖的合成、調(diào)控及其在共生過程中的作用有助于了解根瘤菌和宿主相互作用時(shí)的信號(hào)交流機(jī)制。根瘤菌胞外多糖的合成及分泌運(yùn)輸過程需要很多的基因參與，對(duì)于根瘤菌胞外多糖合成的調(diào)節(jié)也是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，不僅受氮、磷含量等多種環(huán)境因素影響，也受自身多種調(diào)節(jié)基因的調(diào)節(jié)。在中華苜蓿根瘤菌(S.meliloti)中，exo基因參與了胞外多糖的合成過程；exoQ、exoT和exoP參與了胞外多糖的多聚化過程；exsA參與了胞外多

3、糖分泌運(yùn)輸過程；ExoS-ChvI群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控中華苜蓿根瘤菌Ⅱ型胞外多糖的合成過程。中慢生天山根瘤菌分離自我國新疆干旱地區(qū)，可以與其宿主植物烏拉爾甘草共生結(jié)瘤。中慢生天山根瘤菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)于共生結(jié)瘤過程具有重要作用，而其胞外多糖在共生過程中的作用還未曾深入研究。
　　 本研究以中慢生天山根瘤菌為材料，采用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變的方法，篩選得到7株胞外多糖缺失突變株，在基本培養(yǎng)基上不能產(chǎn)生胞外多糖，與野生型菌落表形有明顯差

4、異。通過Arbitrary PCR的方法得到轉(zhuǎn)座子兩端的基因序列，確定突變株中的轉(zhuǎn)座子分別插入了與豌豆根瘤菌pssPONT、exo5基因有較高同源性的mtpABCD、mtpE上，并且克隆得到了完整的基因序列。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mtpABCD、mtpE在基因組上是組成型表達(dá)。為了研究中慢生天山根瘤菌胞外多糖的調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建了mtpC-lacZ融合表達(dá)菌株WP1，該突變株沒有胞外多糖合成能力。用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變的方法篩選胞外多糖基因mtpC的調(diào)

5、控基因，采用Arbitrary PCR的方法得到轉(zhuǎn)座子兩端的基因序列，并亞克隆得到了mtpSR雙組份調(diào)控系統(tǒng)的完整序列。mtpS編碼一個(gè)組氨酸激酶感應(yīng)蛋白，mtpR編碼了一個(gè)調(diào)控蛋白。mtpSR與豌豆根瘤菌中的actSR、大豆根瘤菌中的regSR有較高的同源性，后兩者在共生固氮過程中有重要作用。為了進(jìn)一步研究中慢生天山根瘤菌胞外多糖基因mtpC和雙組份調(diào)控系統(tǒng)mtpSR的調(diào)控機(jī)制，分別在野生型與mtpC-lacZ融合表達(dá)菌株WP1中構(gòu)建

6、了mtpS、mtpR的缺失突變株。在野生型中分別缺失了mtpS和mtpR后，胞外多糖形成能力喪失；在mtpC-lacZ融合表達(dá)菌株WP1中缺失了mtpS和mtpR后，mtpC-laZ的β-半乳糖苷酶活性大大降低。這說明，mtpS和mtpR的缺失影響了mtpC的表達(dá)，mtpSR雙組分調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控了胞外多糖相關(guān)基因mtpC的表達(dá)，mtpSR雙組分調(diào)控系統(tǒng)對(duì)于中慢生天山根瘤菌胞外多糖的形成非常重要。而mtpS和mtpR的缺失對(duì)mtpE的表達(dá)沒

7、有影響，mtpE可能受其他調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控。為了研究中慢生天山根瘤菌胞外多糖在共生過程中的作用，我們進(jìn)行了根毛吸附、生物膜形成、共生結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)。與野生型相比，mtpC、mtpS、mtpR和mtpE的缺失突變株不僅不能形成胞外多糖，也不能形成生物膜，其根毛吸附能力與共生結(jié)瘤能力也完全喪失。這說明胞外多糖在中慢生天山根瘤菌的共生結(jié)瘤過程中起著十分重要的作用。由此，我們推測(cè)中慢生天山根瘤菌通過調(diào)節(jié)胞外多糖的形成來影響生物膜的形成，進(jìn)而影響根毛吸附

8、、共生固氮等共生過程。中慢生型天山根瘤菌中存在一個(gè)與lysE/lysR調(diào)控系統(tǒng)相似的msiA/msiR系統(tǒng)，刀豆氨酸(CAN)作為特異性的信號(hào)分子可以與MsiR蛋白結(jié)合調(diào)控msiA，進(jìn)而影響天山根瘤菌的共生過程。為研究MsiR蛋白關(guān)鍵氧基酸的功能，利用大腸桿菌XL1 Red菌株，構(gòu)建得到msiR基因突變子文庫，以msiA-LacZ作為報(bào)告基因篩選得到10株MsiR蛋白不依賴于刀豆氨酸就能誘導(dǎo)msiA表達(dá)的突變株，與野生型相比，突變株中的