在體生物發(fā)光成像術(shù)觀察骨髓來源細(xì)胞參與脈絡(luò)膜新生血管的形成.pdf

1、研究背景:脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)為年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)等多種眼底疾病視力喪失的主要原因。在CNV進(jìn)程中血管發(fā)生和血管生成同時發(fā)生,最終可導(dǎo)致嚴(yán)重且不可逆的視力喪失。CNV的發(fā)病機(jī)理還未完全闡明,涉及RPE-Bruch膜-光感受器復(fù)合體的衰老,氧化性損傷的積累以及外層視網(wǎng)膜局部缺血的發(fā)展。
　　我研究組前期

2、實(shí)驗(yàn)通過建立C57-GFP嵌合體小鼠觀察了在CNV發(fā)生發(fā)展過程中,骨髓來源細(xì)胞(Bonemarrowderivedcells,BMCs)在CNV聚集、分化和表達(dá)蛋白情況,證實(shí)BMCs在CNV局部可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,這些細(xì)胞除了參與形成新生血管外,還可分泌促血管形成因子如VEGF和bFGF,表明BMCs也在一定程度上調(diào)控著CNV的嚴(yán)重程度。在相同強(qiáng)度的誘發(fā)因素下,高齡小鼠生成的CNV較低齡小鼠

3、更為嚴(yán)重,提示我們年齡因素可能使BMCs對損傷做出超常反應(yīng),從而導(dǎo)致病理性新生血管的生成更為嚴(yán)重。還有研究表明,高齡鼠骨髓細(xì)胞可能存在有功能異常,導(dǎo)致其分化能力發(fā)生改變,從而促進(jìn)生成病理性組織。近期有研究發(fā)現(xiàn),高齡鼠BMCs的增殖能力受損,并有潛在的新生血管形成趨勢。在低氧預(yù)處理后,其血管生成基因表達(dá)增加,因此是否移植高齡者BMCs會影響其臨床治療潛力?
　　組織病理學(xué)檢測是評價注射細(xì)胞分布、移植后成活率及其分化狀態(tài)的最主要方法,

4、但無法實(shí)時和在活體內(nèi)動態(tài)進(jìn)行觀測和評價。生物發(fā)光成像技術(shù)(bioluminescenceimaging,BLI)可以在體、實(shí)時的示蹤各類細(xì)胞的存活、歸巢和分化情況,還可評估骨髓移植后受體的存活狀態(tài)和被移植細(xì)胞的存活狀態(tài),是一項(xiàng)尤其適用于小動物的新興分子影像學(xué)技術(shù)。
　　目的和內(nèi)容:(1)評價BLI監(jiān)測小鼠體內(nèi)BMCs參與CNV形成過程的可行性,為BLI研究CNV發(fā)生機(jī)制打基礎(chǔ);(2)利用BLI觀察不同年齡BMCs參與CNV形成的全

5、過程并結(jié)合組織學(xué)分析,探究年齡如何影響B(tài)MCs參與形成CNV。
　　方法:(1)將熒光素酶-綠色熒光蛋白(Fluc-GFP)雙轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓移植到野生型C57小鼠,將嵌合度>85％的嵌合體小鼠并分為兩組:實(shí)驗(yàn)組利用532nm激光建立小鼠CNV模型,對照組不行CNV造模。于CNV建模后1天、3天、7天、14天、21天和28天,利用小動物成像系統(tǒng)(IVISKinetics)對兩組小鼠進(jìn)行BLI觀察,高靈敏度CCD采集圖像,活體成像軟

6、件系統(tǒng)(LivingImagingVersion4.0)對選取的眼部光學(xué)統(tǒng)計(jì)區(qū)域(Regionsofinterest,ROIs)進(jìn)行分析。(2)小鼠分為兩組,年齡性別匹配,實(shí)驗(yàn)組為Fluc-GFP雙轉(zhuǎn)基因老年小鼠(18月齡)與野生型C57成年小鼠(4月齡)的骨髓移植建立的CNV嵌合體小鼠,對照組為Fluc-GFP雙轉(zhuǎn)基因成年小鼠(4月齡)與野生型C57成年小鼠(4月齡)的骨髓移植建立的CNV嵌合體小鼠。將嵌合度>85%的嵌合體小鼠納入實(shí)

7、驗(yàn),利用532nm激光建立兩組小鼠CNV模型。于CNV建模后1天、3天、7天、14天、21天和28天,利用小動物成像系統(tǒng)(IVISKinetics)對兩組小鼠進(jìn)行BLI觀察,高靈敏度CCD采集圖像,活體成像軟件系統(tǒng)(LivingImagingVersion4.0)對選取的眼部光學(xué)統(tǒng)計(jì)區(qū)域(Regionsofinterest,ROIs)進(jìn)行分析。擇激光后第14天為組織學(xué)實(shí)驗(yàn)的觀察點(diǎn),從組織學(xué)角度分析CNV區(qū)域的BMCs,兩組小鼠同步進(jìn)行,

8、利用圖像分析軟件(Photoshopcs4)來測量各個樣本中CNV的最大直徑和厚度,以像素(pixel)為單位進(jìn)行表示。
　　結(jié)果:(1)造模后第1天,實(shí)驗(yàn)組小鼠即有大量BMCs趨化至CNV部位,前3天趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量增長最快,第7天病變部位BMCs數(shù)量達(dá)峰值,第14天病變部位BMCs數(shù)量降至最低,隨后稍有增加,第28天以后保持穩(wěn)定。對照組小鼠在相應(yīng)時間點(diǎn)眼內(nèi)BMCs數(shù)量較為穩(wěn)定,且明顯低于實(shí)驗(yàn)組小鼠(P<0.05)

9、。(2)實(shí)驗(yàn)組小鼠(老年小鼠骨髓移植給成年小鼠)趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量在CNV建模后14天內(nèi)明顯高于成年小鼠骨髓移植給成年小鼠的對照組(P<0.05),14天后兩組小鼠趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量無明顯差別(P>0.05)。在CNV造模后的第1天至第7天,實(shí)驗(yàn)組小鼠趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量迅速上升,7天時達(dá)到峰值,7天至14天趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量直線下降,14天后降至對照組水平。對照組在相應(yīng)的時間點(diǎn)趨化至CNV

10、部位的BMCs數(shù)量較少且變化較慢,且3天后增長速度下降,7天后趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量即開始下降,到第14天降至最低水平。14天后實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠眼部發(fā)光量無明顯差別,平行且穩(wěn)定變化,28天后,兩組小鼠眼部發(fā)光量均趨于穩(wěn)定。老年鼠骨髓移植給成年鼠的實(shí)驗(yàn)組小鼠無論是CNV厚度,還是CNV直徑都與成年鼠骨髓移植給成年鼠的對照組小鼠有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:利用BLI技術(shù)可以分析對比不同干細(xì)胞參與CNV的能