小腦顆粒神經(jīng)元去極化誘導(dǎo)的上皮生長因子受體間接激活信號傳導(dǎo)途徑是由谷氨酸受體所介導(dǎo).pdf

1、本篇文章主要研究高鉀去極化引起原代培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元ERK1/2磷酸化的機(jī)制。即(1)上皮生長因子受體間接激活是否參與高鉀去極化引起的小腦顆粒神經(jīng)元ERK1/2磷酸化。(2)高鉀去極化引起小腦顆粒神經(jīng)元ERK1/2磷酸化過程中，是否依賴于谷氨酸受體的激活。(3)EGFR相關(guān)配體在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元上的表達(dá)。(4)PKC是否參與上皮生長因子受體間接激活信號傳導(dǎo)途徑。 方法： 采用原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元。將細(xì)胞在37

2、℃無血清相關(guān)培養(yǎng)液中孵育5-60分鐘，含有5mM、10 mM、25 mM、45 mM[K+]e或50μM谷氨酸以及相關(guān)特異性抑制劑。應(yīng)用冰PBS洗滌細(xì)胞，加入裂解液，終止反應(yīng)，收集細(xì)胞。進(jìn)行凝膠電泳，免疫印跡分析。ERK1/2在本文中僅用做樣品加樣的監(jiān)測指標(biāo)，而在統(tǒng)計(jì)分析中未涉及ERK1/2。使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：

3、 1、高鉀誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化高鉀在小腦顆粒神經(jīng)元引起p-ERK1/2升高。在[K+]e。濃度為10 mM、25 mM時(shí)，磷酸化水平略有升高，在25 mM時(shí)，p-ERK1組升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在[K+]e濃度為45 mM時(shí)，磷酸化水平明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[K+]e引起ERK1/2磷酸化的時(shí)間相對較晚，45 mM[K+]e作用在10分鐘后，p-ERK1/2開始升高，20分鐘后升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在40分鐘時(shí)下降，60分鐘后再

4、次升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、上皮生長因子家族相關(guān)成員mRNA表達(dá)在原代培養(yǎng)8天的小腦顆粒神經(jīng)元及成年小鼠小腦內(nèi)，HB-EGF、TGF-α均有表達(dá)。但EGF(上皮生長因子)和Amphiregulin(雙向調(diào)節(jié)蛋白)在神經(jīng)元和小腦內(nèi)均無表達(dá)。 3、TRK、金屬蛋白酶抑制劑和肝素的作用應(yīng)用上皮生長因子受體抑制劑1μMAG1478可以抑制45 mM[K+]e20分鐘引起的ERK1/2磷酸化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而AG1478對4

5、5 mM[K+]e60分鐘引起ERK1/2磷酸化不完全抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 10μM Zn2+依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001，能夠阻斷45 mM[K+]e20分鐘引起的ERK1/2磷酸化。1mg/ml肝素能夠抑制此磷酸化反應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、谷氨酸和其受體拮抗劑的作用應(yīng)用50μM谷氨酸作用于神經(jīng)元，可引起與去極化相似的ERK1/2磷酸化。50μM谷氨酸引起小腦顆粒神經(jīng)元ERK1/2磷酸化，此反應(yīng)可以被

6、AG1478、GM6001所抑制。NMDA受體拮抗劑MK801(1 μM)和非NMDA受體拮抗劑CNQX(10μM)也能夠抑制谷氨酸引起的ERK1/2磷酸化。另外，NMDA受體拮抗劑MK801和非NMDA受體拮抗劑CNQX也可抑制45 mM[K+]e在20分鐘和60分鐘引起的ERK1/2磷酸化。 5、在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)液中細(xì)胞外高鉀的作用將神經(jīng)元在不含谷氨酸前體-谷氨酰胺的鹽溶液中孵育，細(xì)胞外的谷氨酸濃度明顯降低，高鉀誘導(dǎo)的谷

7、氨酸釋放也被抑制。將細(xì)胞暴露45 mM[K+]e20分鐘和60分鐘可引起ERK1/2的磷酸化升高，但AG1478無抑制作用。表明在此條件下，高鉀刺激的EPK1/2的磷酸化不依賴于EGFR間接激活。 6、PKC抑制劑的影響將神經(jīng)元在不含谷氨酰胺培養(yǎng)液中孵育，45 mM[K+]e在20分鐘時(shí)引起的ERK1/2的磷酸化，PKC抑制劑GF109203X不能抑制該磷酸化反應(yīng)。在含有谷氨酰胺的培養(yǎng)液中，高鉀引起的ERK1/2的磷酸化升高主要

8、是由于去極化導(dǎo)致谷氨酸釋放增加。此反應(yīng)在20分鐘時(shí)可被GF109203抑制。但是對60分鐘時(shí)同樣條件TERK1/2的磷酸化沒有影響。在含有谷氨酰胺的培養(yǎng)液中，50μM的谷氨酸刺激5分鐘后ERK1/2的磷酸化增加可被PKC的抑制劑不完全抑制。雖然50 μM的谷氨酸條件下PKC抑制劑抑制作用輕微，但是明顯超過了沒有谷氨酸條件下PKC抑制劑的作用。 討論： 目前研究表明，上皮生長因子家族成員至少有7種：HB-EGF、TGF-α

9、、EGF、Amphiregulin、BTC(β-細(xì)胞素)、EPR(表皮調(diào)節(jié)素)和epigen。僅前四種在腦內(nèi)表達(dá)，其中HB-EGF、TGF-α僅存在于小腦及原代培養(yǎng)顆粒神經(jīng)元。應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測在體內(nèi)小腦顆粒神經(jīng)元上有TGF-α的表達(dá)。HB-EGF在發(fā)育初期腦內(nèi)表達(dá)水平達(dá)到高峰，并在腦內(nèi)持續(xù)表達(dá)。EGF在前腦和皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞存在表達(dá)，而在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元以及成年小腦內(nèi)均無表達(dá)。 上皮生長因子受體家族(ErbB家族)廣

10、泛存在于腦內(nèi)，包括ErbB1(EGFR)、ErbB2、ErbB3和ErbB4，并且已證實(shí)在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元上表達(dá)。該受體激活引起受體酪氨酸激酶磷酸化，進(jìn)而激活有絲分裂活化蛋白激酶(包括ERK1/2)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)。ErbB4對于神經(jīng)元遷移和突觸可塑性具有重要意義。小腦顆粒神經(jīng)元中表達(dá)的神經(jīng)體調(diào)節(jié)蛋白是一種ErbB4的激動(dòng)劑，能夠誘導(dǎo)放射膠質(zhì)細(xì)胞形成和顆粒細(xì)胞的遷移。在原代培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元中，EGF能夠引起MAP

11、激酶活化。 基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、3、9在小腦內(nèi)表達(dá)，可能參與間接激活過程。在對皮質(zhì)擴(kuò)散性抑制的研究中發(fā)現(xiàn)，伴隨著大量K+和谷氨酸的釋放，位于大腦皮層的MMP9發(fā)生活化。 在神經(jīng)元上皮生長因子受體間接激活的研究中，早期發(fā)現(xiàn)該途徑存在于GT1-7細(xì)胞系(促性腺激素釋放激素下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞系)中。另外，經(jīng)去極化、緩激肽以及cAMP處理的PC12細(xì)胞(嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系)也存在上皮生長因子受體間接激活信號傳導(dǎo)通路。然而，目前在

12、原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中尚無EGFR間接激活報(bào)道。該信號傳導(dǎo)途徑所涉及的生長因子釋放相當(dāng)復(fù)雜，而且可能具有細(xì)胞特異性、G蛋白耦聯(lián)受體特異性和發(fā)育生物學(xué)特異性。最近我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中，α-腎上腺素能受體激動(dòng)劑右旋美托咪啶通過G蛋白βγ亞基，蛋白激酶C、Scr激酶、金屬蛋白酶以及TRK活化，從而引起ERK1/2的磷酸化。在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元中，星形膠質(zhì)細(xì)胞約占總含量的5-10％，主要表達(dá)代謝性谷氨酸受體，目前尚無NMD

13、A受體在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的報(bào)道。所以，星形膠質(zhì)細(xì)胞上皮生長因子受體的激活不可能成為去極化引起小腦顆粒神經(jīng)元ERK1/2的磷酸化的機(jī)制。 本課題研究表明在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元由高鉀去極化誘導(dǎo)的ERKl／2的磷酸化是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程。高鉀去極化條件下在20和60分鐘引起谷氨酸釋放進(jìn)而引起ERK1/2磷酸化。僅在20分鐘時(shí)ERK1/2磷酸化依賴于PKC活性。在相同條件下，50 μM的谷氨酸5分鐘引起的ERK1/2的磷酸化增加僅部

14、分依賴于PKC活性，說明其對PKC抑制劑不敏感。但高鉀去極化在20和60分鐘時(shí)所誘發(fā)ERK1/2磷酸化并不完全依賴。EGFR的間接激活，并且20分鐘時(shí)也不依賴于PKC的活化。在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元中，NMDA受體抑制劑MK801和非NMDA受體抑制劑CNQX可以阻斷高鉀去極化及谷氨酸引起的ERK1/2磷酸化，提示該過程依賴于NMDA受體和非NMDA受體的激活，這與Baron等人在海馬切片上發(fā)現(xiàn)一致，CNQX可以完全阻斷KCl引起ER

15、K1/2磷酸化，而NMDA受體拮抗劑AP5也部分抑制該反應(yīng)。在對小腦顆粒神經(jīng)元研究中，早期發(fā)現(xiàn)NMDA受體的激活可以引起ERK1/2磷酸化，但以前的研究均沒有闡述是否存在上皮生長因子受體間接激活。 最近研究發(fā)現(xiàn)，小腦的顆粒細(xì)胞突觸上存在谷氨酸NMDA受體和PKC依賴性的LXP。在對小腦切片有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放與鈣離子動(dòng)力學(xué)的研究表明，谷氨酸受體激活后引起大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使電壓依從Ca2+通道開放，進(jìn)一步釋放游離Ca2+，從

16、而使細(xì)胞游離Ca2+增加。另外，小腦的顆粒細(xì)胞的激活并不依賴突觸的刺激，而主要通過樹突電壓依從性的鈣通道開放，使細(xì)胞游離Ca2+增加引起的。上述發(fā)現(xiàn)提示，谷氨酸受體介導(dǎo)和去極化誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化在小腦顆粒神經(jīng)元的重要性，但有關(guān)PKC在其中的具體作用目前還不很清楚。 結(jié)論： 原代培養(yǎng)7-8天小鼠小腦顆粒神經(jīng)元，高鉀引起ERK1/2磷酸化，該過程依賴于谷氨酸的釋放和谷氨酸NMDA和非NMDA受體調(diào)節(jié)。高鉀去極化引起小腦