骨髓間充質(zhì)干細胞移植對慢性阻塞性肺病氣道及肺實質(zhì)損傷的修復作用.pdf

1、慢性阻塞性肺病(COPD)是人類的常見病，是世界范圍內(nèi)第四位的死亡原因。近年來，隨著環(huán)境污染等因素的加重，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢。COPD以不完全可逆的氣流受限為特征，病情呈進行性發(fā)展，其發(fā)病機制復雜，病理學改變則累及肺臟的多級結(jié)構(gòu)，包括中央及周圍的氣道、肺實質(zhì)乃至肺血管。目前認為，COPD的病理損傷屬于不可逆性病變，依靠機體自身的能力無法達到組織的完全修復。因此，迫切需要尋找到一種參與肺部組織結(jié)構(gòu)的修復和重建的有效方法。 研

2、究認為，骨髓中的造血干細胞(hematopoieticstemcells，HSC)和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)都具有多向分化的潛能，其中MSC由于取材方便、來源豐富、容易培養(yǎng)、增殖力旺盛而日益成為干細胞研究的熱點。近年來大量研究顯示，間充質(zhì)干細胞在治療諸如糖尿病、心肌梗塞、移植物抗宿主反應等多種疾病方面具有廣闊的臨床應用前景。 之前有研究已證實，骨髓MSC可以在體內(nèi)、體外分化為肺實質(zhì)細胞

3、，在炎癥等因素的趨化下，外源的骨髓MSC有向肺損傷部位匯集的現(xiàn)象。外源MSC可能通過兩方面參與肺的損傷修復：1．在局部微環(huán)境作用下誘導分化為肺泡上皮和支氣管上皮細胞等結(jié)構(gòu)細胞，參與組織的修復過程；2．通過免疫調(diào)節(jié)作用，為損傷修復提供的有利環(huán)境。 但目前而言，應用MSC干預治療COPD的相關(guān)研究十分少見，現(xiàn)有的關(guān)于肺部疾病干細胞治療的有限相關(guān)研究，主要集中在急性肺實質(zhì)損傷和肺纖維化方面。而且，對于不同移植條件對干細胞治療效果也沒有

4、相應的對比研究。因此，本課題經(jīng)過嚴格的對比和系統(tǒng)的觀察，研究觀察了移植的骨髓MSC在COPD動物模型肺局部的定植存活情況，了解MSC移植的治療效果。本研究包括三部分內(nèi)容，分述如下。 一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)和生物學特性 目的：分離和培養(yǎng)大鼠MSC(rMSC)，研究其生物學特征，為動物實驗做準備。 方法：取6-8周齡正常雄性Wistar大鼠的股骨和肱骨，無菌狀態(tài)下沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸液，接種于塑料培

5、養(yǎng)皿，使用10％FBS/DMEM-LG的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2和100％飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，每3-4d按照1：3進行常規(guī)方法傳代；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學特點；MTT法繪制細胞生長曲線；流式細胞儀檢測細胞表面標記和細胞周期；定向誘導rMSC在體外向成骨細胞和脂肪細胞分化；裸鼠皮下注射rMSC檢測其成瘤性。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的rMSC大部分呈梭形的成纖維細胞樣形態(tài)，細胞呈輻射狀排列。在體外觀察傳代20代，細胞形態(tài)和生長速

6、度無明顯改變；生長匯合率達30％-40％和90％時的P5代rMSC，G0/G1期細胞的百分比分別為53.07％和85.24％，S+G2+M期細胞的百分比分別為46.93％和14.76％：P5代細胞高表達CD29、CD44．和Sca-1，而不表達造血干細胞的標記CD34、CD117和CD45，不表達FIk-1、MHC-Ⅱ；在體外誘導培養(yǎng)下，rMSC可向成骨細胞和脂肪細胞分化，具有多向分化潛能；裸鼠背部種植rMSC，3個月未見成瘤現(xiàn)象。

7、 結(jié)論：全骨髓貼壁法可成功分離和培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，分離所得的細胞性狀穩(wěn)定、狀態(tài)良好，形態(tài)學和表型符合間充質(zhì)干細胞特點，具有多向分化潛能且無明顯成瘤性。 二、COPD模型的構(gòu)建和鑒定 目的：研究建立合理的慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型的有效方法。 方法：8周齡健康Wistar大鼠15只，隨機分入健康對照組(C組)和兩個COPD模型組。用兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS200μg/次)加熏香煙1個月的復

8、合刺激法(A組)和單純熏煙法(B組)分別建立大鼠COPD模型，然后行病理學檢測造模效果，包括平均內(nèi)襯間隔(MLI)和平均肺泡數(shù)(MAN)的測定；觀察實驗動物一般情況：檢測動物的外周血常規(guī)和支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)與分類。 結(jié)果：兩COPD模型組大鼠納差消瘦，伴有間歇咳嗽和氣促。病理學檢查顯示兩模型組均具有慢性支氣管炎和肺氣腫的典型病變。兩模型組外周血和BALF中的白細胞總數(shù)及中性粒細胞百分比均較健康對照組顯著增高(P

9、＜0.01)；兩模型組MLI較對照組有顯著性增高，而MAN較對照組顯著性下降(P＜0.01)；但A、B兩組間無顯著差異(P＞0.05)。病理學切片上，A組比B組各級支氣管及肺組織的炎癥浸潤更明顯，上皮細胞損傷和腺體增生明顯；而B組更突出表現(xiàn)為肺泡的過度擴大融合。 結(jié)論：用單純熏煙法和兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS200μg/次)加熏香煙的方法，均可成功制備大鼠COPD模型，其病理生理改變與人類COPD類似，后者比前者更符合COPD

10、自然發(fā)病過程。 三、MSC在COPD大鼠模型肺部的定植分化與治療作用 目的：觀察rMSC移植在COPD動物肺部的定植和分化及其治療作用。 方法：選健康雌性Wistar大鼠36只，隨機分為5組：rMSC小劑量/單次尾靜脈移植組(A組，12只，COPD大鼠，尾靜脈輸注rMSC1×106/1ml)；rMSC大劑量/兩次尾靜脈移植組(B組，12只，COPD大鼠，尾靜脈輸注rMSC1×106/1ml×2次)；rMSC對照組

11、(C組，4只，正常大鼠，處理同A組)；COPD模型組(D組，4只，尾靜脈輸注生理鹽水1ml)；健康對照組(E組，4只)。體外培養(yǎng)擴增雄性Wistar大鼠來源的rMSC，以CM-Dil標記細胞后將其經(jīng)尾靜脈注入用熏煙加LPS氣管注入法制作的同系雌性COPD大鼠模型體內(nèi)，在注射后的1d、7d、15d、30d分別處死動物，取新鮮肺組織冰凍切片熒光顯微鏡下觀察Dil陽性細胞定植、分布和存活時間；原位雜交法檢測肺組織中外源細胞的定位、定植效率，以

12、及形態(tài)學觀察和在肺外臟器的分布：CM-Dil聯(lián)合免疫組化法檢測rMSC在肺組織的轉(zhuǎn)分化情況；觀察肺組織病理學變化以及血常規(guī)、肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)與分類；使用雙抗夾心ELISA方法檢測COPD大鼠BALF和外周血中IL-10、TNF-α和G-CSF的表達情況。實驗數(shù)據(jù)采用SSPS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，檢驗水平為α=0.05。 結(jié)果：(1)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A、B兩組在進行rMSC移植后，肺組織內(nèi)有較多的CM-Di

13、l陽性細胞(紅色熒光)進入，主要分布于肺間質(zhì)、肺泡和氣道壁，并可在肺局部存留30d以上；而C組肺組織內(nèi)偶見少量熒光陽性細胞；未經(jīng)rMSC移植的D、E組肺組織內(nèi)未見陽性細胞。(2)原位雜交結(jié)果與CM-Dil檢測結(jié)果類似，并可見原位雜交陽性的細胞光鏡下呈現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮和氣道粘膜上皮形態(tài)，血管平滑肌細胞也可見少量陽性細胞；心臟、骨骼肌和肝臟等肺外組織未見或極少見外源細胞；A、B兩組肺組織內(nèi)的外源細胞定植效率無明顯差異。(3)CM-Dil染色聯(lián)

14、合免疫組化檢測提示，部分CM-Dil陽性細胞同時有免疫組化檢測SPC或CC16表達陽性，提示外源細胞部分轉(zhuǎn)分化為Ⅱ型肺泡上皮和氣道粘膜上皮。(4)A、B組外周血和BALF中的白細胞總數(shù)及中性粒細胞分類較D組有顯著降低(P＜0.01)，但仍高于C和E組(P＜0.01)，提示rMSC移植后COPD炎癥水平有所下調(diào)。(5)A、B組外周血和BALF中的IL-10較D組有顯著性升高(P＜0.01)，但低于C和E兩組(P＜0.01)；TNF-α和G