Ⅰ、CD133在人結(jié)腸癌細(xì)胞分化中的作用研究;Ⅱ、熒光標(biāo)記腫瘤轉(zhuǎn)移體內(nèi)模型的建立.pdf

1、本論文分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：CD133在人結(jié)腸癌細(xì)胞分化中的作用
　　 在本研究中，首先我們用Western blotting檢測(cè)了44種人腫瘤細(xì)胞系中CD133的表達(dá)，其中8種細(xì)胞呈CD133陽(yáng)性表達(dá)，5個(gè)來(lái)源于結(jié)腸癌。接著我們分選了結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中CD133high和CD133。的亞群，發(fā)現(xiàn)CD133high的HCT116細(xì)胞在體外生長(zhǎng)快于CD133-的HCT116細(xì)胞，并有更高的克隆形成率。CD

2、133high亞群和CD133-的HCT116亞群細(xì)胞相比，S期和G2/M期細(xì)胞比例更高。但是在BALB/c-nu/nu鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，CD133high/+和CD133-的HCT116細(xì)胞并沒(méi)有明顯的區(qū)別。將分選后的CD133high/+和CD133-的HCT116細(xì)胞體外培養(yǎng)，CD133的分布趨向于和未分選前的HCT116細(xì)胞相同。我們的研究結(jié)果提示不能單用CD133一個(gè)分子標(biāo)記來(lái)富集結(jié)腸癌細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞。
　　 我們進(jìn)

3、一步研究了CD133的表達(dá)和結(jié)腸癌分化的關(guān)系。我們按照CD133的表達(dá)量，將結(jié)腸癌細(xì)胞HT29分為了四個(gè)亞群，以ALP活性作為分化程度的指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示不同亞群的分化狀態(tài)和CD133的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)用丁酸鈉誘導(dǎo)HT29和HCT116分化后，流式檢測(cè)這兩種細(xì)胞表面的CD133/1和CD133/2的免疫活性都呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴的下降。但是Western Blotting卻未檢測(cè)到細(xì)胞中CD133總蛋白水平的改變。我們還設(shè)計(jì)

4、了三對(duì)針對(duì)人CD133分子的siRNA，其中兩對(duì)可以在體外有效干擾CD133表達(dá)。但是干擾CD133的表達(dá)對(duì)HT29和HCT116細(xì)胞的增殖、克隆形成、周期分布和分化狀態(tài)都沒(méi)有明顯的影響。CD133可能不是細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)控基因。
　　 總的來(lái)說(shuō)，CD133不是結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116特異的腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記，而只是結(jié)腸癌分化相關(guān)的一個(gè)指標(biāo)。
　　 第二部分：熒光標(biāo)記腫瘤轉(zhuǎn)移體內(nèi)模型的建立
　　 本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染p

5、EGFP-N1質(zhì)粒，藥物篩選后無(wú)限稀釋得到了四株強(qiáng)表達(dá)綠色熒光蛋白的單克隆細(xì)胞株-人宮頸癌細(xì)胞HeLa-GFP、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116-GFP、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-GFP和小鼠宮頸癌細(xì)胞U14-GFP。
　　 我們把HeLa-GFP以8×106個(gè)/只的劑量皮下接種于BALB/c-nu/nu裸鼠，成瘤潛伏期是3-5天，成瘤率為100％。利用Photometrics活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，可以清楚直觀的觀察表達(dá)GF

6、P的HeLa-GFP移植瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。接種后第60天處死全部荷瘤鼠，解剖后大體成像僅有一只可見(jiàn)同側(cè)腋窩下淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。取U14-GFP以8×106個(gè)/只接種C57BL/6J小鼠，移植成瘤的潛伏期是2-4天，成瘤率100％。利用Photometrics活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，可分別在第22天、28天、37天和52天觀察荷瘤小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)展過(guò)程。在U14-GFP原發(fā)瘤體積≥5 cm3時(shí)，肺部和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別為67％和100％。我們還

7、將HCT116-GFP進(jìn)行了皮下移植和尾靜脈注射，用Berthold活體成像儀觀察了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。利用Berthold活體成像系統(tǒng)可見(jiàn)HCT116-GFP移植瘤在體內(nèi)仍可強(qiáng)表達(dá)GFP。HCT116-GFP尾靜脈注射后第43天，可用Berthold活體成像系統(tǒng)檢測(cè)到GFP陽(yáng)性的皮下轉(zhuǎn)移腫瘤。
　　 最后，我們還檢測(cè)了兩種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CD44和E-cadherin在HeLa-GFP和U14-GFP細(xì)胞移植瘤中的表達(dá)。免疫組