蛋白激酶TTK的動(dòng)力學(xué)研究及其羧基末端D domain在其激酶活性中作用的研究.pdf

1、細(xì)胞周期調(diào)控在生物細(xì)胞中起著十分重要的作用，它調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長和分化。如果細(xì)胞周期調(diào)控出錯(cuò)會(huì)導(dǎo)致許多嚴(yán)重的后果，從而最終引發(fā)癌癥。例如：在有絲分裂過程中細(xì)胞周期錯(cuò)誤會(huì)引起基因組的不穩(wěn)定或者染色體分離的異常。而有絲分裂過程受到許多蛋白激酶的調(diào)控，這些激酶的分子機(jī)制及信號傳導(dǎo)通路有待被研究。因此，研究有絲分裂過程中起調(diào)控作用的蛋白激酶的分子機(jī)制有十分重要的意義，而且有助于進(jìn)一步了解有絲分裂激酶在癌癥中的作用。
　　 在有絲分裂過程中

2、起調(diào)節(jié)作用的一種激酶叫TTK/Mps1。它由MPS1(MonoPolar Spindle1)基因編碼，是一種重要的具有雙重專一性的蛋白激酶，該酶對于肽鏈中的絲氨酸，蘇氨酸以及酪氨酸殘基具有專一性的磷酸化作用。該酶在真核生物的進(jìn)化上十分保守。最近，蛋白激酶TTK已經(jīng)被認(rèn)為是生物基因穩(wěn)定性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因?yàn)樗{(diào)節(jié)著許多細(xì)胞有絲分裂的重要步驟。例如：TTK不僅是紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)的重要組成成分，而且能夠修正錯(cuò)誤的染色體排列。其激酶活性是檢驗(yàn)點(diǎn)信號

3、傳導(dǎo)所必需的，他在有絲分裂中能夠確保染色體的正常分離。在細(xì)胞周期中，TTK活性的喪失會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂錯(cuò)誤，出現(xiàn)非整倍體，這通常會(huì)導(dǎo)致癌癥的產(chǎn)生，因?yàn)椴徽５募?xì)胞分裂是癌細(xì)胞的一個(gè)顯著特點(diǎn)。研究表明Mps1可以作為一種治療癌癥的新手段，然而這種治療方法的成功運(yùn)用，需要對蛋白激酶TTK的活性有更加深入的研究。本文主要的工作內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.利用病毒表達(dá)體系從昆蟲Highs細(xì)胞中純化得到TTK蛋白激酶。
　　 為了研究

4、TTK激酶活性的動(dòng)力學(xué)機(jī)制和酶學(xué)特征，本論文首先利用病毒表達(dá)體系在昆蟲high5細(xì)胞中對TTK進(jìn)行了有效地表達(dá)與純化。這就克服了從E.coli中純化的TTK，由于缺少必要的后翻譯修飾，酶活性低的缺點(diǎn)。由于TTK比較容易降解，在構(gòu)建載體時(shí)，分別在TTK的N末端加了GST-tag和在C末端加了His-tag。因此可以采用兩步連續(xù)純化的方法，得到均一的全長TTK。第一步，先用GST純化，并用3C蛋白酶在柱切割以去除GST標(biāo)簽，然后第二步用Ni

5、+柱進(jìn)行his純化，接著用thrombin蛋白酶切除His標(biāo)簽，最后純化得到有活性的全長TTK蛋白激酶用于酶的動(dòng)力學(xué)研究。為了研究D domain在TTKA蛋白激酶磷酸化活性中的作用，同時(shí)構(gòu)建了去除D domain的突變體(TTK-d)，并得到分離純化。
　　 2.對Hela細(xì)胞中內(nèi)源TTK進(jìn)行定量，結(jié)果表明TTK的蛋白水平受細(xì)胞周期的調(diào)控。
　　 然后，為了證實(shí)TTK的蛋白水平是否受細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控以及它是否在中心體

6、復(fù)制過程中起重要作用，觀測了有絲分裂的Hela細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞周期中的TTK蛋白水平的變化，并測定了在不同細(xì)胞周期進(jìn)程中內(nèi)源TTK的濃度。結(jié)果顯示，TTK的蛋白水平在有絲分裂間期很低，但是在有絲分裂期也就是紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)的活躍期其蛋白水平會(huì)增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在正常的細(xì)胞周期過程中，G1/S期時(shí)細(xì)胞內(nèi)的TTK濃度瞬時(shí)增加，在G2/M期達(dá)到最大值，然后在G1期又回到最低的初始水平以進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期。TTK的這種變化趨勢與另外兩種調(diào)控有絲分裂的

7、關(guān)鍵蛋白-CyclinB和Cdk的變化趨勢是相似的。這些結(jié)果說明TTK水平受細(xì)胞周期的調(diào)控，另外，TTK蛋白水平的增加也與中心體復(fù)制的時(shí)間相一致，因此，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以作為中心體復(fù)制需要TTK活性的一個(gè)新證據(jù)。
　　 3.激酶實(shí)驗(yàn)表明TTK自身磷酸化的分子機(jī)制是分子間相互作用，而且TTK的自身磷酸化能夠增強(qiáng)其對底物的磷酸化。
　　 本論文還對TTK的自身磷酸化的分子機(jī)制，即該酶的自身磷酸化是分子內(nèi)還是分子間的相互作用進(jìn)行了

8、研究。結(jié)果表明TTK的自身磷酸化的速率取決于TTK的濃度，它隨著TTK蛋白濃度的增加而增加，這一結(jié)果證明了TTKA的自身磷酸化的機(jī)制是酶分子之間的一種作用，因?yàn)槿绻欠肿觾?nèi)的作用，自身磷酸化的速率將不會(huì)隨著酶分子濃度的變化而變化。此外，本論文對該酶的自身磷酸化作用和底物磷酸化作用之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。將已經(jīng)先自身磷酸化的TTK和未自身磷酸化的TTK分別作用于底物TTKA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TTK的自身磷酸化作用會(huì)增強(qiáng)其對底物的磷酸化作用。這就

9、使得其催化的反應(yīng)速率曲線由Lag變成了直線，這也正是自身磷酸化是分子間作用的蛋白激酶的普遍現(xiàn)象。
　　 4.動(dòng)力學(xué)研究表明TTK蛋白激酶的催化機(jī)制是序列反應(yīng)。
　　 為了更深入地闡述TTK磷酸化活性的催化機(jī)制，用放射性同位素活性測定的方法，測定了TTK對底物磷酸化作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并用雙底物試驗(yàn)測定了TTK的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過不同的ATP濃度和不同的底物TTKA的雙底物試驗(yàn)，測得TTK對ATP和TTKA兩種底物的Km值

10、分別是54uM和74uM，經(jīng)用MATLAB軟件對多組試驗(yàn)數(shù)據(jù)的非線性擬合分析，結(jié)果表明直線都相交于一點(diǎn)，這說明TTK的酶學(xué)機(jī)制是三重復(fù)合物機(jī)制，而且在兩個(gè)底物之間有消極的相互作用。
　　 5.對突變體(TTK-d)的研究表明TTK羧基末端的D domain在酶對底物的磷酸化過程中起促進(jìn)作用。
　　 本論文研究了TTK羧基末端的D domain(aa792-853)在酶的底物磷酸化中的作用，首先構(gòu)建了敲除D domain的

11、TTK突變體(TTK-d)，并用與野生型TTK相同的方法在昆蟲High5細(xì)胞中過量表達(dá)，純化。純化得到的TTK-d突變體與野生型TTK相比，突變體的自身磷酸化活性沒有顯著變化但對底物的磷酸化活性降低3-5倍。這就表明D domain對酶的自身磷酸化沒有太大影響，但對于酶的底物磷酸化有一定作用。最后，本論文也對TTK-d進(jìn)行了雙底物穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定與分析。TTK-d的ATP的Km和TTK-wt基本相當(dāng)，但TTK-d對另一底物TTKA的K

12、m(130μM)值比wt的高，說明TTK-wt對TTKA有更高的結(jié)合。由此推測，D domain中的氨基酸殘基可能與catalytic domain的氨基酸殘基相互作用以有利于酶與底物TTKA的結(jié)合，從而提高酶的活性。
　　 總之，本論文首次對TTK激酶活性的動(dòng)力學(xué)機(jī)制進(jìn)行了研究，通過雙底物動(dòng)力學(xué)分析闡明了TTK是序列反應(yīng)催化機(jī)制并且推測了羧基末端的D domain在TTK激酶活性中的作用。該研究結(jié)果為人類蛋白激酶家族的研究打下