T淋巴細(xì)胞亞群在肝移植術(shù)后長期生存患者外周血中變化的研究.pdf

1、肝移植是目前治療終末期肝臟疾病的一種有效方法。與其它器官移植相比，肝移植的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在排斥反應(yīng)較易控制，特別是在肝腎、肝胰等多器官聯(lián)合移植中，肝移植可有效誘導(dǎo)受體對腎、胰形成免疫耐受，從而對其他器官的形成和存活發(fā)揮保護(hù)作用[1]。近年來，輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞在肝移植術(shù)后免疫反應(yīng)中的作用研究越來越受到重視。T細(xì)胞是參與移植排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受的免疫細(xì)胞之一，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著極其重要的調(diào)節(jié)和效應(yīng)作用。通過大量的動物和臨床試驗(yàn)，一些

2、免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子等在移植免疫中作用機(jī)制和作用特點(diǎn)被陸續(xù)報道，部分免疫細(xì)胞也開始應(yīng)用于臨床實(shí)踐。
　　 肝移植術(shù)后患者機(jī)體免疫功能的改變，主要表現(xiàn)在T淋巴細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子水平的變化，在排斥反應(yīng)和免疫耐受患者的外周血中各亞群及細(xì)胞因子的水平存在差異表達(dá)，而其最終在機(jī)體中的平衡是維持患者發(fā)生持續(xù)性免疫耐受的保證。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(輔助T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞)是維持機(jī)體排斥反應(yīng)和免疫耐受平衡的主要因素，而排斥反應(yīng)與免

3、疫耐受的發(fā)生取決于效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)T細(xì)胞之間的相互博弈，要限制效應(yīng)T細(xì)胞的作用，減小肝移植術(shù)后病人機(jī)體排斥反應(yīng)，就必須誘使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞積極發(fā)揮抑制效應(yīng)。目前研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對多種免疫細(xì)胞及其細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)效應(yīng)[2-4]，在動物實(shí)驗(yàn)中己證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有顯著減輕移植物抗宿主病發(fā)生的作用機(jī)制[5-7]。此外，有學(xué)者應(yīng)用體外擴(kuò)增的CD4+CD25+T細(xì)胞來降低小鼠移植后發(fā)生的移植物抗宿主排斥反應(yīng)[8-10]，取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。本課

4、題以肝移植術(shù)后長期生存(即產(chǎn)生免疫耐受)患者的外周血為研究對象，檢測血中Th1細(xì)胞、CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞(Ts)及CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)水平，探討肝移植術(shù)后產(chǎn)生免疫耐受患者外周血中Th1細(xì)胞、CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞(Ts)及CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)特點(diǎn)及其與FK506之間的相關(guān)性，為肝移植術(shù)后患者產(chǎn)生免疫耐受和用藥指標(biāo)提供指示性依據(jù)。
　　 目的:
　　

5、 通過檢測肝移植術(shù)后長期生存患者外周血中Th1細(xì)胞和CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞(Ts)及CD4+CD25+Foxp3+Treg水平，探討肝移植術(shù)后長期生存患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化規(guī)律，分析三者變化與FK506的相關(guān)性，證實(shí)其在臨床檢驗(yàn)和免疫學(xué)中的診斷意義。
　　 方法:
　　 1.選取重慶某醫(yī)院肝移植術(shù)后持續(xù)治療患者40例：男23人，女17人；年齡段在45～58歲之間，病人肝移植術(shù)后未發(fā)生排斥反應(yīng)。將肝移

6、植組分為存活2-3年患者，共20例；存活8-10年患者，20例；健康人20例，體檢各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。集中采集所選對象靜脈外周血，肝素抗凝，編號備用。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1血清學(xué)檢測40例肝移植術(shù)后患者及其20例健康人的肝功能，評估AST，ALT，GGT，ALB以及FK506血藥濃度
　　 2.2外周血中單個核細(xì)胞(PBMC)的分離；
　　 2.3淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)；
　　 2.4淋巴

7、細(xì)胞的收集與分組；
　　 A組：Th1細(xì)胞(IL-2)檢測組；
　　 B組：CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞檢測組；
　　 C組：CD4+CD25+Foxp3+Treg檢測組；
　　 2.5流式細(xì)胞檢測
　　 A組加入Anti-Human IL-2/PE10ul；
　　 B組加入Anti-Human CD3/PE、Anti-Human CD8/FITC各10ul；
　　 C組加入

8、Anti-Human CD4/PerCP-Cy5.5、Anti-Human CD25/PE以及Anti-HumanFoxp3/APC各10ul；
　　 流式細(xì)胞儀檢測外周血單個核細(xì)胞的比例。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 處理數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x-±s表示，并采用方差分析和t檢驗(yàn)處理，P<0.05時代表差異具有顯著性。相關(guān)性分析采用Pearson法，P<0.05代表具有相關(guān)性。
　　

9、 結(jié)果:
　　 1、肝移植術(shù)后生存2-3年患者以及肝移植術(shù)后生存8-10年患者肝功能與健康對照組AST、ALT和ALB三項(xiàng)指標(biāo)都無顯著性差異(P>0.05)，而GGT在肝移植術(shù)后患者中相對于健康對照組顯著增高(P<0.01)。術(shù)后血藥濃度情況：肝移植術(shù)后生存2-3年患者血清中FK506為7.58±0.47ng/ml；8-10年患者，血清中FK506為4.21±0.3ng/ml，顯著高于健康對照組中的血藥濃度；同時，肝移植后生存

10、8-10年患者血清中FK506濃度顯著低于生存2-3年患者，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2、20名健康人和40名肝移植術(shù)后患者外周血中Th1細(xì)胞、CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞水平：肝移植術(shù)后2-3年患者外周血中Th1細(xì)胞約占32.15±3.05％，CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞占23.34±2.87%，CD4+CD25+Foxp3+Treg占17.87±3.22%；肝移植術(shù)后8-1

11、0年患者外周血中Th1細(xì)胞約占18.71±2.97％，CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞占18.32±2.54%，CD4+CD25+Foxp3+Treg占10.76±2.21%；健康人外周血中Th1細(xì)胞約占12.26±2.35%，CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞占10.74±3.21%，CD4+CD25+Foxp3+Treg占6.43±1.12％。與健康人組比較，肝移植術(shù)后生存2-3年患者組外周血中Th1(IL-2)細(xì)胞、CD3+CD

12、8 low抑制性T細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比計數(shù)水平均顯著高于健康人對照組水平(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；生存8-10年患者CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞百分比計數(shù)水平顯著高于健康人對照組水平(P<0.05)；而Th1細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比計數(shù)較生存2-3年患者中的水平顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；生存8-10年患者中CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞較生存2

13、-3年患者中的水平雖然也降低，但無顯著性差異(P>0.05)。此外，生存8-10年患者中這些T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果較2-3年患者更接近健康對照組的水平。
　　 3、通過對40例肝移植術(shù)后長期生存患者外周血中FK506與Th1細(xì)胞、CD3+CD8low抑制性T細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)散點(diǎn)圖Pearson和相關(guān)性分析，可知FK506濃度與Th1(IL-2)、CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞及CD4+CD25+F

14、oxp3+Treg呈直線正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1、肝移植術(shù)后長期生存患者同健康人比較，其外周血中Th1細(xì)胞、CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg水平均高于健康人組水平，肝移植術(shù)后患者產(chǎn)生免疫耐受一定程度上取決于Th1細(xì)胞、CD3+CD8 low抑制性T細(xì)胞(Ts)以及CD4+CD25+Foxp3+Treg之間的動態(tài)平衡。
　　 2、肝移植術(shù)后患者外周血中Th1細(xì)胞、C