大鼠阿霉素腎病中Podocin、Laminin和Fibronectin的表達及意義.pdf

1、目的：
　　 大鼠阿霉素腎病模型于20世紀80年代初期由國外文獻所報道，是目前公認的能較好模擬人類腎臟疾病的動物模型。大鼠阿霉素腎病具有慢性進展性腎損害特點，阿霉素通過破壞腎小球濾過屏障而引起蛋白尿。Podocin、Laminin（層粘蛋白，LN）、Fibronectin(纖連蛋白，F(xiàn)N)均參與腎小球濾過屏障的組成，對維持腎小球的正常濾過功能發(fā)揮著重要作用。Podocin、LN、FN在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中是如何變化的？它們與蛋

2、白尿的產(chǎn)生之間有無相互作用及作用機制尚不清楚。因此本課題從大鼠阿霉素腎病模型入手，通過動態(tài)觀察Podocin、LN、FN在腎組織中的表達、分布情況及其與24小時尿蛋白的關(guān)系，探討其在蛋白尿發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制及其相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1、將30只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠隨機分為正常對照組（6只）和阿霉素腎病模型組（24只）。阿霉素腎病模型組大鼠首次尾靜脈注射阿霉素(6.5mg/kg)，七天

3、后再次經(jīng)尾靜脈注射阿霉素(4mg/kg)的方法建立模型。模型建立后隨機將阿霉素腎病模型組大鼠分為模型2周組、4周組、6周組、8周組，每組各6只。正常對照組大鼠于相應(yīng)時間點尾靜脈注射等劑量生理鹽水。
　　 2、立春紅法觀察大鼠24小時尿蛋白定量(24hnp)，全自動生化儀檢測血漿白蛋白(Alb)、血膽固醇(Cho1)、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的變化，并比較模型各組與正常對照組間生化指標的差別。
　　 3、光鏡下

4、觀察各組大鼠腎組織的病理學(xué)變化，并比較模型各組與正常對照組間的差別。
　　 4、用免疫組織化學(xué)二步法及冰凍切片免疫熒光法檢測各組大鼠腎組織中Podocin、LN和FN的表達及分布情況，并比較這三種蛋白在各模型組之間及與對照組間的表達情況及其與24小時尿蛋白定量的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1、各組大鼠腎臟病理變化特點
　　 光鏡下對照組大鼠腎小球毛細血管叢管腔開放程度好，未見腎小球節(jié)段硬化，腎小管上皮細胞

5、排列整齊。模型組大鼠隨著造模時間的增加，其腎小球系膜細胞數(shù)量依次增多，腎小管上皮細胞出現(xiàn)顆粒及空泡變性，腎小管內(nèi)蛋白管型明顯增多。
　　 2、各組生化指標比較
　　 模型2、4、6、8周組大鼠蛋白尿持續(xù)升高。其中模型6、8周組大鼠的24小時尿蛋白定量及血液生化指標（血漿白蛋白、血膽固醇、血肌酐和血尿素氮）與對照組比較，差異有顯著意義(P＜0.05)。模型組出現(xiàn)大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥、腎功能減退，表現(xiàn)為典型的腎病

6、綜合征。
　　 3、Podocin、LN、FN蛋白表達（免疫組化）情況
　　 免疫組織化學(xué)二步法測定結(jié)果顯示，對照組podocin蛋白僅在腎小球基膜呈棕黃色顆粒強陽性表達，podocin沿腎小球基膜呈均勻連續(xù)的線性分布。陰性對照腎組織無陽性表達。模型2、4、6、8周組podocin蛋白的表達均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。對照組LN、FN蛋白在腎小球系膜區(qū)、基膜呈棕黃色顆粒少量表達。模型2、4、6、8

7、周組LN、FN蛋白的表達明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4、Podocin、LN、FN蛋白免疫熒光定位
　　 冰凍切片免疫熒光觀察結(jié)果顯示，對照組podocin蛋白主要分布在腎小球內(nèi)，沿腎小球毛細血管袢呈均勻線性分布。模型2、4、6、8周組大鼠podocin蛋白隨病變進展開始出現(xiàn)不連續(xù)分布。對照組LN蛋白主要分布于系膜基質(zhì)及基膜（包括腎小球、腎小囊、腎小管基膜）；FN主要分布于系膜基質(zhì)。模型2

8、、4、6、8周組LN、FN蛋白的表達隨時間進展表達皆增強。模型各組大鼠腎組織中podocin的表達均低于對照組(P＜0.01)，且隨著造模時間的加長呈遞減趨勢。模型各組大鼠腎組織中LN和FN的表達均高于對照組(P＜0.01)，且隨著造模時間的加長呈遞增趨勢。
　　 5、Podocin、LN、FN蛋白與24小時尿蛋白水平的相關(guān)性
　　 24小時尿蛋白定量與podocin蛋白的表達呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

9、24小時尿蛋白定量與LN、FN蛋白的表達均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、阿霉素所致的腎病綜合征模型隨著造模周期的延長表現(xiàn)為大量蛋白尿，白蛋白逐漸降低，血肌酐、血尿素氮、血膽固醇逐漸升高，病變腎小球系膜細胞及基質(zhì)逐漸增多
　　 2、Podocin表達異常與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是參與腎病病程進展的重要因素。
　　 3、層粘蛋白、纖連蛋白過表達很可能參與了病變腎