單鏈脫氧寡核苷酸介導的低密度脂蛋白受體基因點突變小鼠肝臟原位修復研究.pdf

1、目的： 低密度脂蛋白受體(LDLR)基因突變可導致家族性高膽固醇血癥(FH).修飾的單鏈脫氧寡核苷酸(MSO)可在基因組的任意位點糾正突變的堿基。本文旨在用反義MSO(A-MSO)對小鼠在體肝細胞中的點突變的LDLR基因進行原位修復研究。 方法： 1.HepG2細胞I,DLR基因無義突變模型原位修復1.1構(gòu)建并鑒定LDLR-蟲螢光素酶融合蛋白(LDLR-luc)表達載體將野生型(WT)或660突變型(無義突變)L

2、DLR基因連接到蟲螢光素酶基因(luc)5’端，構(gòu)建pWT-LDLR-luc和p660-LDLR-luc。因660-LDLR基因上存在一個C到A的點突變，導致一個無義突變和HinfI酶切位點。DNA測序鑒定質(zhì)粒。 1.2制備和鑒定HepG2細胞LDLR基因無義突變模型將p660-LDLR-luc瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞，檢測轉(zhuǎn)染后48 h HepG2細胞裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA)以鑒定無義突變模型。 1.3 MSO原

3、位修復HepG2細胞LDLR基因無義突變反義MSO(A-MSO)或正義MSO(S-MSO)可序列特異地置換堿基導致突變修復。A-MSO或S-MSO與p660-LDLR-luc共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后72 h檢測HepG2細胞裂解液的FLA以驗證無義突變能否修復，并篩選出較佳的MSO鏈。 2小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變模型原位修復2.1驗證水動力法的肝靶向性小鼠用水動力法轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-luc，檢測肝、心、肺、腎和

4、脾組織裂解液的蟲螢光素酶活性(FLA)，以驗證水動力法的肝靶向性。 2.2制備和鑒定小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變模型小鼠用水動力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc，檢測肝FLA和PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析以鑒定小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變模型。 2.3 MSO肝靶向原位修復小鼠在體肝細胞LDLR基因無義突變小鼠水動力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc 12 h，以多聚乙烯亞(PEI)為

5、載體結(jié)合水動力法把MSO輸送到小鼠肝臟。給A-MSO 60 h后，檢測小鼠肝組織裂解液的FLA，以判斷無義突變是否修復。 2.4 DNA水平驗證無義突變修復PCR-RFLP和DNA測序以驗證LDLR基因無義突變是否修復. 結(jié)果： 1.HepG2細胞實驗1.1 WT-LDLR和660-LDLR的DNA測序結(jié)果P660-LDLR-luc在LDLR基因上存在一個C到A的突變(TGA),pWT-LDLR-luc則否。

6、 1.2蟲螢光素酶在HepG2細胞中的表達比較轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細胞裂解液的FLA。結(jié)果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc低，但比對照組(轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-EGFP)高，差異顯著(p<0.01)。這表明無義突變可能未完全終止蟲螢光素酶的表達。 1.3 A-MSO和S-MSO在HepG2細胞中增強p660-LDLR-1uc表達蟲螢光素酶比較用p660-LDLR-luc和各種MSO共轉(zhuǎn)染的Hep

7、G2細胞的FLA，結(jié)果顯示A-MSO和S-MSO均可明顯增強p660-LDLR-luc表達蟲螢光素酶，且A-MSO較S-MSO強，差異顯著(P<0.01)。 2小鼠實驗 2.1目的質(zhì)粒靶向小鼠肝臟小鼠水動力法轉(zhuǎn)染pWT-LDLR-luc后72 h，檢測小鼠肝、心、肺、腎和脾組織裂解液的FLA。結(jié)果顯示小鼠肝組織FLA較高，而肝外組織幾乎檢測不到FLA。這表明水動力法轉(zhuǎn)染導致了目的質(zhì)粒的肝特異性轉(zhuǎn)染。 2.2蟲螢光

8、素酶在小鼠肝細胞中的表達及PCR-RFLP結(jié)果比較分別轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的小鼠在體肝組織裂解液的FLA。結(jié)果顯示p660-LDLR-luc組比pWT-LDLR-luc組低，但比對照組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1)高，差異顯著(p<0.01).這表明無義突變在小鼠肝臟中可能未完全終止蟲螢光素酶的表達。PCR-RFLP分析表明小鼠肝細胞LDLR基因無義突變未被自動修復。 2.3 A-MSO在小鼠肝細胞中增強p660-LDLR-luc表達蟲螢光素

9、酶比較A-MSO組和C-MSO(對照MSO)組的FLA，結(jié)果表明A-MSO組的FLA明顯高于C-MSO組的FLA(p<0.01). 2.4突變堿基A被置換成堿基CPC-RFLP分析和DNA測序進一步表明LDLR基因上的堿基A被置換成C。 結(jié)論： 小鼠水動力法轉(zhuǎn)染p660-LDLR-luc可用于制備小鼠在體肝細胞LDLR基因點突變模型。PEI結(jié)合水動力法可使A-MSO有效靶向肝臟。A-MSO可肝內(nèi)原位修復點突變的L