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1、血小板生成素(Thrombopoitin,TPO)是刺激巨核細(xì)胞增殖與分化的主要細(xì)胞因子,通過(guò)其受體Mpl的結(jié)合作用調(diào)節(jié)血小板生成。但是研究表明,在TPO基因敲除的小鼠中,巨核細(xì)胞和血小板雖然減少90﹪,但小鼠仍然正常發(fā)育,這提示除TPO外,還有其他的代償機(jī)制或有未發(fā)現(xiàn)的Mpl配體蛋白存在,與TPO一起調(diào)節(jié)血小板生成。 本實(shí)驗(yàn)室利用酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two hybrid system),以Mpl的胞外區(qū)域?yàn)檎T餌,篩選人
2、胎肝cDNA文庫(kù),獲得的一個(gè)與Mpl相互結(jié)合的蛋白,序列分析表明該蛋白為人核遷移蛋白hNUDC。通過(guò)一系列的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),證明該蛋白為Mpl的另一枚配體。 為了進(jìn)一步確定Mpl與TPO、hNUDC兩個(gè)配體的結(jié)合部位,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Mpl結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行缺失突變,構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)及融合熒光蛋白的真核表達(dá)載體,分別在酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在酵母雙雜交系統(tǒng)中,將Mpl系列區(qū)克隆在酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌質(zhì)粒pGBKT7上,將TPO及
3、hNUDC克隆于pGADT7上,在釀酒酵母菌株AH109中進(jìn)行酵母雙雜交反應(yīng)。對(duì)報(bào)告基因的檢測(cè)表明,Mpl的兩個(gè)配體TPO及hNUDC均與Mpl的CRM1中靠近細(xì)胞膜端。同時(shí)用構(gòu)建的缺失Mpl膜外相關(guān)區(qū)、融合綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)載體,hNUDC、TPO融合紅色熒光蛋白(DsRed1)表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)Mpl特異區(qū)蛋白的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行ELISA、免疫共沉淀研究,進(jìn)一步確定TPO、hNUDC與Mpl結(jié)合
4、部位在Mpl-D1-S2區(qū),與酵母雙雜交結(jié)果一致。該區(qū)域含有造血細(xì)胞因子受體的特征氨基酸序列Trp-Ser-Xaa-Trp-Set(即WSXWS box)的退化序列WGXWS及一段Mpl特異的序列“插入?yún)^(qū)”,表明WGXWS序列以及插入?yún)^(qū)對(duì)Mpl與配體的結(jié)合起關(guān)鍵的作用。確定hNUDC、TPO與Mpl作用部位后,我們以NIH3T3細(xì)胞作為模式細(xì)胞,用hNUDC蛋白體外處理無(wú)血清培養(yǎng)的、穩(wěn)定表達(dá)Mpl、Mpl-D1、Mpl-D2、Mpl-D
5、1-S1、Mpl-D1-S2、EGFP的NIH3T3細(xì)胞,MTT法分析hNUDC蛋白對(duì)細(xì)胞活力影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),hNUDC蛋白可以提高穩(wěn)定表達(dá)Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2的NIH3T3細(xì)胞活力。為了進(jìn)一步研究hNUDC與Mpl及不同區(qū)域蛋白的相互影響作用,用融合綠色熒光蛋白基因的pMpl-EGFP、pMpl-D1-EGFP、pMpl-D1-S2-EGFP真核表達(dá)載體DNA與融合紅色熒光蛋白基因的phNUDC-DsRed1真核表
6、達(dá)載體DNA共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,以及利用hNUDC蛋白進(jìn)一步體外處理穩(wěn)定表達(dá)Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的Mpl-EGFP-NIH3T3細(xì)胞、Mpl-D1-EGFP-NIH3T3細(xì)胞及Mpl-D1-S2-NIH3T3細(xì)胞,結(jié)果表明,hNUDC可以改變穩(wěn)定表達(dá)Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài),形成巨核、多核,使細(xì)胞具有巨核細(xì)胞分化的一些特征;hNUDC蛋白體外可以誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)Mp
7、l、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的NIH3T3細(xì)胞ERK、P38蛋白磷酸化,引起ERK、P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。用phNUDC-DsRedl載體轉(zhuǎn)染表達(dá)Mpl的NIH3T3細(xì)胞,用高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及微管熒光抗體標(biāo)記高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微管,發(fā)現(xiàn)Mpl可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及微管系統(tǒng)介導(dǎo)hNUDC蛋白的分泌作用。共轉(zhuǎn)染也發(fā)現(xiàn)Mpl-D1-S2能介導(dǎo)hNUDC蛋白的分泌作用。 總之,本論文確定了hNUDC、TPO與Mpl的結(jié)合部位,研究了
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