發(fā)卡樣LOX-1基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：越來越多的研究證據(jù)表明血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成密切相關(guān),其直接證據(jù)來源于LOX-1在人和動(dòng)物動(dòng)脈粥樣斑塊中的高表達(dá)。LOX-1正逐漸成為心血管疾病的生物標(biāo)記物和一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn),抑制LOX-1的表達(dá)將有利于防止動(dòng)脈粥樣硬化的形成。RNA干擾

2、(RNA interference,RNAi)是將外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞而引起與dsRNA同源的mRNA降解,進(jìn)而抑制其相應(yīng)的基因表達(dá)的技術(shù),具有高度的序列特異性、高效性、長(zhǎng)效性等優(yōu)點(diǎn),已成為基因功能研究和基因治療研究的重要工具。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中,循環(huán)單核細(xì)胞趨化、聚集、黏附到血管內(nèi)皮是AS的最早期事件,由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子和黏附分子在介導(dǎo)循環(huán)單核細(xì)胞趨化

3、、聚集、黏附到血管內(nèi)皮的過程中起了至關(guān)重要的作用。氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein,Ox-LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化最明確的危險(xiǎn)因子之一,Ox-LDL可能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子和趨化因子,從而募集單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮黏附。Fractalkine作為一種能趨化單核細(xì)胞的新發(fā)現(xiàn)的趨化因子,Ox-LDL能否誘導(dǎo)和上調(diào)Fractalkine的表達(dá)及其信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚。單核/巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞

4、的形成是動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志之一,巨噬細(xì)胞通過清道夫受體介導(dǎo)對(duì)氧化修飾脂蛋白的攝取是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵。LOX-1和CD36都是巨噬細(xì)胞中Ox-LDL的主要受體,但是,在巨噬細(xì)胞攝取Ox-LDL變成泡沫細(xì)胞的過程中,LOX-1和CD36所起的作用可能有所不同。在巨噬細(xì)胞中Ox-LDL能上調(diào)CD36的表達(dá)并且能夠促進(jìn)對(duì)Ox-LDL的攝取,但Ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞中LOX-1表達(dá)的調(diào)節(jié)尚有爭(zhēng)議。
　　目的：(1)構(gòu)建一個(gè)靶向LOX-1基

5、因的發(fā)卡樣siRNA(short hairpin smallinterference RNA,shRNA)真核表達(dá)載體,并檢測(cè)其對(duì)LOX-1基因的抑制效應(yīng),為進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)防治動(dòng)脈粥樣硬化提供一種研究基礎(chǔ)。(2)探討Ox-LDL能否誘導(dǎo)和上調(diào)趨化因子Fractalkine和MCP-1的表達(dá)及其細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,為防治AS提供一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。(3)探討巨噬細(xì)胞中LOX-1是否參與了Ox-LDL對(duì)清道夫受體CD36表達(dá)的調(diào)節(jié)。

6、
　　方法：(1)根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則,以LOX-1為靶基因設(shè)計(jì)并合成小發(fā)卡結(jié)構(gòu)兩端配對(duì)的siRNA寡核苷酸鏈,再經(jīng)變性、復(fù)性后形成雙鏈LOX-1 shRNA。采用DNA重組技術(shù),將LOX-1 shRNA雙鏈與線性化pGenesil-1質(zhì)粒表達(dá)載體連接,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),半定量RT-PCR方法檢測(cè)LOX-1 mRNA的表達(dá),western-blot方法檢測(cè)LOX-1蛋白水平表達(dá)。(2)分別用25

7、mg/L、50 mg/L、100 mg/L的Ox-LDL與培養(yǎng)的HUVECs共孵育24小時(shí),半定量RT-PCR方法檢測(cè)LOX-1、Fractalkine和MCP-1的mRNA表達(dá);western-blot檢測(cè)LOX-1和Fractalkine蛋白表達(dá);ELISA方法檢測(cè)MCP-1含量。(3)預(yù)先對(duì)HUVECs轉(zhuǎn)染pGenesil-1LOX-1shRNA和用PD98059預(yù)處理HUVECs,再用50 mg/L的Ox-LDL刺激,半定量RT

8、-PCR方法檢測(cè)LOX-1、Fractalkine和MCP-1的mRNA表達(dá);western-blot檢測(cè)LOX-1和Fractalkine及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá);ELISA方法檢測(cè)MCP-1含量。(4)100ng/ml的佛波酯與人單核細(xì)胞株THP-1共孵育72小時(shí),誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。預(yù)先用CD36特異性中和抗體阻斷巨噬細(xì)胞中CD36的作用,再分別用25mg/L、50mg/L、100mg/L的Ox-LDL共孵育24

9、小時(shí),半定量RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞LOX-1和CD36的mRNA表達(dá),western-blot檢測(cè)LOX-1和CD36的蛋白表達(dá)。(5)在RNA干擾抑制巨噬細(xì)胞LOX-1表達(dá)基礎(chǔ)上預(yù)先用CD36特異性中和抗體阻斷CD36的作用,再用50mg/L的Ox-LDL共孵育24小時(shí),半定量RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞LOX-1和CD36的mRNA表達(dá),western-blot檢測(cè)LOX-1和CD36的蛋白表達(dá)。(6)分別加入CD36中和抗體和LOX

10、-1基因沉默后,用Ox-LDL(50 mg/L)刺激巨噬細(xì)胞,分別在0h、6h、12h、24h、48h用半定量RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞LOX-1和CD36的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)成功合成了發(fā)卡樣LOX-1基因的RNA干擾表達(dá)載體;LOX-1基因的發(fā)卡樣siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,LOX-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)(p＜0.01)。(2)Ox-LDL能夠呈濃度依賴性上調(diào)LOX-1、Fractalki

11、ne和MCP-1的基因和蛋白水平表達(dá),與對(duì)照組比較p＜0.01。而用RNA干擾抑制LOX-1的表達(dá)后,顯著抑制了Ox-LDL(50 mg/L)刺激HUVECs引起的Fractalkine和MCP-1的基因和蛋白表達(dá),與對(duì)照組比較p＜0.01。(3)用PD98059預(yù)處理和用RNA干擾抑制LOX-1的表達(dá),顯著抑制了Ox-LDL(50 mg/L)刺激HUVECs引起的p-ERK1/2蛋白表達(dá),同時(shí)也抑制了Fractalkine和MCP-1

12、的基因表達(dá)。(4)100ng/ml的佛波酯與人單核細(xì)胞株THP-1共孵育72小時(shí)能成功誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。(5)阻斷CD36后,加入不同濃度Ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞24小時(shí),其LOX-1和CD36的mRNA和蛋白表達(dá)呈濃度依賴性上調(diào)(p＜0.01),未加CD36中和抗體組與對(duì)照組(只加CD36中和抗體,未加Ox-LDL)比較,LOX-1和CD36的mRNA及蛋白表達(dá)差異無顯著性(p＞0.05)。(6)同時(shí)抑制LOX-1和阻斷CD36的

13、作用后,顯著抑制了Ox-LDL(50mg/L)刺激后CD36的mRNA和蛋白表達(dá),與對(duì)照組比較p＜0.01。(7)用CD36特異性中和抗體后,LOX-1 mRNA表達(dá)在6小時(shí)就已經(jīng)顯著增加,24小時(shí)達(dá)最高表達(dá),48小時(shí)的時(shí)候開始有下降趨勢(shì),CD36 mRNA表達(dá)在6小時(shí)亦顯著增高,以后在12小時(shí)和24小時(shí)繼續(xù)增加,至48小時(shí)達(dá)最高表達(dá),與0h比較p＜0.01;LOX-1基因沉默后,CD36 mRNA的表達(dá)在12小時(shí)才開始表達(dá)增加(與0h

14、比較p＜0.05),24小時(shí)表達(dá)顯著增加(與0h比較p＜0.01),48小時(shí)達(dá)最高表達(dá)(與Oh比較p＜0.01)。
　　結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了能有效抑制LOX-1表達(dá)的發(fā)卡樣LOX-1基因RNA干擾表達(dá)載體。(2)氧化低密度脂蛋白能夠呈濃度依賴性上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子Fractalkine和MCP-1的表達(dá);這種誘導(dǎo)作用與活化LOX-1—ERK1/2的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。(3)氧化低密度脂蛋白能夠呈濃度依賴性上調(diào)THP-1源