膽囊膽固醇結(jié)石形成與肝膽管轉(zhuǎn)運(yùn)子相關(guān)的研究.pdf

1、膽囊膽固醇結(jié)石是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，其首要的病理生理缺陷為膽囊膽汁中膽固醇的非生理性過飽和。膽固醇的過飽和主要是由于內(nèi)環(huán)境的紊亂，其可能原因有(1)肝臟膽固醇的高分泌；(2)分泌進(jìn)入膽汁的膽鹽和磷脂的降低；(3)以上二者的聯(lián)合作用。目前認(rèn)為，膽汁的形成和分泌主要與肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)。這些蛋白的表達(dá)或功能的改變可能影響膽汁的組成，從而對(duì)膽固醇結(jié)石的形成起到一定的作用。其中的一些蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用已基本明確，例如轉(zhuǎn)運(yùn)膽鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)子有?；?/p>

2、膽酸鈉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium taurocholate cotransporting ploypeptide，NTCP)、膽鹽輸出泵(bile saltexport pump，BSEP)、多重耐藥蛋白2(multidrug resistance protien 2，MRF2)；轉(zhuǎn)運(yùn)卵磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)子有多重耐藥因子3(multiple drug resistance 3，MDR3)，轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)子有固醇攜帶蛋白(sterol carrie

3、r protien2，SCP2)。目前，這些因子在膽固醇結(jié)石形成中的作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到較充分的印證，但它們與人膽固醇結(jié)石形成的關(guān)系尚未得到進(jìn)一步地證實(shí)。本次研究將對(duì)中國人膽囊膽固醇結(jié)石形成與這些基因的表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行研究，以明確這些基因在人膽囊膽固醇結(jié)石形成的作用，為今后對(duì)膽囊膽固醇結(jié)石的診斷、治療提供依據(jù)。 方 法 1．標(biāo)本來源：本研究實(shí)驗(yàn)組為膽囊膽固醇結(jié)石患者的肝組織20例，收集的樣本均為膽囊手術(shù)行肝活檢而得。

4、所有樣本經(jīng)生化和影像學(xué)檢查證實(shí)無肝臟疾病；對(duì)照組為正常的肝組織，其中5例來源于肝破裂患者的正常肝組織，5例來源于我院移植科保存的正常肝組織，均無膽結(jié)石。主要試劑：Trizol(invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega公司)，Tag DNA聚合酶(華美公司)，dNTP(華美)，DNA marker(華美)，NTcP、BSEP、MRP2、MDR3、SCP2的擴(kuò)增引物由上海生工工程有限公司制作，兔抗人的NTCP、BSEP、M

5、RP2、MDR3、SCP2抗體及鼠抗兔的IgG抗體(由紐約州立大學(xué)右溪分校醫(yī)學(xué)部分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))。 2．方法：對(duì)全部樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，然后從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各隨機(jī)選取4例應(yīng)用Western blot從蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，然后通過圖像采集和分析系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，利用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(RT-PCR結(jié)果采用均數(shù)表示，Western blot結(jié)果采用中位數(shù)表示)。 結(jié) 果 1．膽固醇結(jié)石病人

6、的肝細(xì)胞的BSEP mRNA的表達(dá)(0.47±0.18)顯著低于非膽固醇結(jié)石人群(0.90±0.42，P<0.01)，同時(shí)蛋白的表達(dá)兩組間也存在較大差異(90.16±18.82 vs 186.17±4.34)；MRP2 mRNA的表達(dá)(1.12±0.39)顯著低于非膽固醇結(jié)石人群(2.48±0.89，P<0.01))，蛋白的表達(dá)兩組間也存在較大差異(45.43±22.77 vs 160.47±30.19)；而NTCPmRNA的表達(dá)(0.

7、56±0.31)與非膽固醇結(jié)石人群(0.76±0.28)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2．膽固醇結(jié)石病人的肝細(xì)胞的MDR3 mRNA的表達(dá)(1.02±0.24)顯著低于非膽固醇結(jié)石人群(1.94±0.80，P<0.01)，同時(shí)蛋白的表達(dá)兩組間存在較大差異(61.08±14.77 vs 100.84±15.44)。 3．膽固醇結(jié)石病人的肝細(xì)胞的SCP2 mRNA的表達(dá)(0.90±0.34)顯著高于非膽固醇結(jié)石人群(0

8、.56±0.19，P<0.05)，同時(shí)蛋白的表達(dá)兩組間也存在較大的差異(190.76±5.17 vs 119.96±15.39)。 1．本研究通過對(duì)膽固醇結(jié)石病人及非膽固醇結(jié)石人肝細(xì)胞上膽鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)子BSEP、MRP2、NTCP的mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)BSEP、MRP2的mRNA和蛋白在結(jié)石組中的表達(dá)均下降，提示BSEP、MRP2在膽固醇結(jié)石形成的過程中起到了一定的作用，因?yàn)锽SEP、MRP2都是肝細(xì)胞膽管膜側(cè)的膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子，其

9、表達(dá)的減少與膽汁中膽鹽含量的降低直接相關(guān)，從而導(dǎo)致膽汁中溶解的生理一生化平衡被打亂，產(chǎn)生膽固醇非生理性的過飽和。膽固醇過飽和導(dǎo)致膽囊內(nèi)膽固醇水化物結(jié)晶沉淀，進(jìn)而結(jié)晶凝聚形成成熟的膽石。本研究結(jié)果顯示，NTCP的mRNA在兩組中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？紤]一方面由于NTCP是肝細(xì)胞基底膜側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)子，其作用是將膽鹽從血液中轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞內(nèi)，因而可能對(duì)肝細(xì)胞分泌膽鹽的影響不大；另一方面，本組樣本量較少，若要徹底闡明NTCP與膽囊膽固醇結(jié)石形成的關(guān)系，

10、仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。 2．本研究通過對(duì)膽固醇結(jié)石病人及非膽固醇結(jié)石人肝細(xì)胞的MDR3的mRNA、和蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，膽固醇結(jié)石病人的肝細(xì)胞的MDR3 mRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)低于非膽固醇結(jié)石人群，提示MDR3在膽固醇結(jié)石形成中起到了一定的作用。MDR3為肝細(xì)胞膽管膜側(cè)的卵磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)子，其表達(dá)的降低會(huì)減少卵磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)，使膽汁中卵磷脂的含量降低，從而降低膽固醇的溶解度、膽固醇非生理性的過飽和。膽固醇過飽和導(dǎo)致膽囊內(nèi)膽固醇水化物結(jié)晶

11、沉淀，進(jìn)而結(jié)晶凝聚形成成熟的膽石。 3．本研究通過對(duì)膽固醇結(jié)石病人及非膽固醇結(jié)石人肝細(xì)胞的SCP2的mRNA和蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，膽固醇結(jié)石病人的肝細(xì)胞的SCP2 mRNA的表達(dá)和蛋白的表達(dá)高于非膽固醇結(jié)石人群，提示SCP2在膽固醇結(jié)石形成中起到了一定的作用。SCP2主要存在于過氧化物酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)中，它一方面作為膽固醇代謝的調(diào)節(jié)因子，參與膽固醇的生物合成和膽固醇向膽汁酸、膽固醇脂及類固醇激素的轉(zhuǎn)化；另一方面作為膽固醇

12、轉(zhuǎn)運(yùn)器，參與細(xì)胞內(nèi)、質(zhì)膜間膽固醇的運(yùn)輸，并能將肝臟新合成的膽固醇直接從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)快速轉(zhuǎn)運(yùn)至膽汁。所以，SCP2表達(dá)的增加將提高膽汁中膽固醇的含量，因而導(dǎo)致膽固醇非生理性的過飽和。膽固醇過飽和導(dǎo)致膽囊內(nèi)膽固醇水化物結(jié)晶沉淀，進(jìn)而結(jié)晶凝聚形成成熟的膽石。 結(jié) 論 1．膽囊膽固醇結(jié)石病人的BSEP、MR．V2的mRNA和蛋白的表達(dá)均下降，BSEP、MRF2的表達(dá)降低可能與膽囊膽固醇結(jié)石的形成有關(guān)。 2．NTCP與膽囊